阿托伐他汀對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管間質纖維化的保護作用

張國欣 薛蘭芬 聶麗敏 王蕾 潘志蘭 許靜

腎間質纖維化是多種腎臟疾病的共同特征，是進展至終末期腎病的共同通路［1］。本實驗通過單側輸尿管結扎術建立腎間質纖維化動物模型，并進行藥物干預，通過免疫組織化學、病理組織學檢查等方法檢查肝細胞生長因子(HGF)在腎小管間質的表達情況及用藥后的變化，進一步了解他汀類藥物的腎保護作用機制，為腎間質纖維化的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 阿托伐他汀鈣片(立普妥，進口注冊證號:H2030119，10 mg/片，Godeck GmbH生產，輝瑞制藥有限公司分裝)。兔抗大鼠HGF多克隆抗體。SP免疫組化試劑盒。以上均購自北京中山生物技術有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗動物與分組:清潔級健康雄性 Wistar大鼠54只(購自河北醫科大學動物實驗中心)，體重180～220 g。適應性飼養1周后，隨機分為假手術組(A組)、模型組(B組)、阿托伐他汀治療組(C組)，每組18只。每組又因于術后第3、7、14天分批處死而分為N3、N7、N14組，每組6只。

1．2．2 動物模型建立:術前空腹12 h，予 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)經腹腔注射麻醉后。下腹正中切口2．5 cm暴露左側腎臟，分離左側輸尿管，于中上1/3處結扎并剪斷，使左腎完全梗阻，后逐層縫合。A組開腹后只游離輸尿管，不結扎。

1．2．3 給藥方法:于術前3 d開始灌胃。C組給予阿托伐他汀(10 mg·kg－1·d－1，溶于 0．9% 氯化鈉溶液，制成混懸液)，A組及B組給予等量0．9%氯化鈉溶液灌胃。實驗期間大鼠自由進食水。

1．2．4 標本收集與制備:分別于術后第3、7、14天斷頭處死。留取血標本2 ml，檢測血清總膽固醇(TC)。迅速切取左腎，去除包膜，按冠狀位縱行剖開，置于10%中性甲醛中固定。48 h后行石蠟包埋，將腎組織切成5μm切片，行HE、Masson及免疫組織化學染色。

1．2．5 生化檢查:血標本采用日本Olympus AU-2700全自動生化分析儀測定血TC。

1．3 病理檢查

1．3．1 組織固定、脫水、滲蠟、包埋:組織塊置于10%中性甲醛中，固定48 h，不同濃度的乙醇梯度脫水各2 h，其中95%2次，無水乙醇脫水3次，各30 min。二甲苯脫乙醇3次，各30 min。石蠟浸入3次，分別為30 min、30 min、1 h。石蠟冷卻包埋。

1．3．2 載玻片的處理:載玻片經硫酸洗液浸泡24 h以上，95%乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗3～5次，將載玻片整齊排好，在烤箱中烤干。用純丙酮以1:150稀釋粘合劑 APES，將載玻片浸入其中1～2 min，取出低溫(37℃)烤干。

1．3．3 切片:應用切片機，厚度為5μm，切片后于37℃恒溫箱中過夜。

1．3．4 石蠟切片脫蠟至水:二甲苯脫石蠟2次，各15 min，無水乙醇浸入2次，各10min，95%、80%、70%、60%、50%乙醇浸入各2 min，自來水、蒸餾水反復沖洗。

1．3．5 HE染色:脫蠟至水的切片浸入蘇木素3 min，水洗。1%鹽酸乙醇分化片刻，水洗。1%氨水溶液藍化片刻，水洗。0．5%伊紅乙醇浸染3 min。70%乙醇1 min，取出甩干，80%乙醇1min，取出甩干，95%乙醇1 min，3個無水乙醇各2 min，3個二甲苯各2 min。最后樹膠封片。

1．3．6 Masson染色:切片常規脫蠟至水(同HE染色)，置于麗春紅染液2 min，入2%冰醋酸水溶液2 min，入5%磷鉬酸水溶液煤染2 min，再入2%冰醋酸水溶液2 min，甲基綠染色3 min，自來水沖洗。95%乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

綠色為膠原纖維，在高倍鏡(×200)下隨即選擇15個不含腎小球及血管的腎皮質視野，以腎間質面積占一個視野場面積的百分比作為相對間質容積值。

1．3．7 免疫組織化學染色(采用SP法):①5μm石蠟切片常規脫蠟至水(同HE染色)。②新鮮配置的3%H2O2孵育10～15 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。③蒸餾水沖洗3次，畫蠟邊。④抗原修復，采用水煮法。切片放入盛有抗原修復液(0．1 mol/L 的 PBS，pH 值 7．2 ～7．4)的小燒杯中，并將燒杯置于盛有自來水的大燒杯中，電爐上加熱煮沸。從小燒杯的溫度到達98～99℃起開始計時20 min。⑤用1%BSA(小牛血清白蛋白)封閉，室溫孵育10～15 min(封閉組織內電荷)，傾去血清，勿洗。⑥滴加1/50稀釋的一抗，4℃過夜。⑦PBS沖洗5 min，3遍。⑧滴加生物素標記的二抗，37℃孵育60 min。⑨PBS沖洗 5 min，3遍。⑩滴加 SP復合物，37℃孵育 30～40 min。〇11PBS 沖洗 5 min，3 遍。〇12顯色:PBS 4 m l、DAB 5 g、H2O25μl，顯色5 min左右(以鏡下適度為好)。〇13自來水沖洗5次。〇14蘇木素復染1 min，水洗，1%鹽酸酒精分化，脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

采用1%BSA代替一抗的組織切片作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。光鏡下陽性反應部位為棕黃色。應用真彩色醫學圖像分析系統通過光學顯微鏡攝入圖像，放大200倍，每例切片隨機選取15個不含腎小球和小血管的腎皮質視野，測定陽性著色部位的總積分光密度值，并取其平均值為腎小管間質 ICAM-1、P-選擇素、NF-κB、ColⅢ表達的陽性面積與著色強度綜合評價指標。

1．4 統計學分析應用SPSS10．0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用t檢驗，對數據進行相關分析并對相關系數r進行顯著性t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 TC的變化 C組單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠在阿托伐他汀的干預下，TC的變化與A組及B組比較差異均無統計學意義(P ＞0．05)。見表1。

表1 3組總膽固醇水平比較n=6，mmol/L，±s

表1 3組總膽固醇水平比較n=6，mmol/L，±s

時間 A組 B組 C組2．1 ±0．3 2．1 ±0．4 2．3 ±0．3術后第7 天 2．1 ±0．3 2．1 ±0．5 2．1 ±0．2術后第14天術后第3天2．1 ±0．5 2．1 ±0．3 2．2 ±0．5

2．2 腎組織形態學改變 經HE、Masson染色，光鏡下觀察A組從第3天到第14天腎組織未見明顯病理改變。B組術后第3天開始出現腎間質水腫、單核細胞浸潤，遠端腎小管上皮細胞扁平、腎間質增寬的特征，腎小球未見明顯異常;術后第7天腎小管明顯擴張，腎間質大量炎性細胞浸潤，管腔內可見脫落的上皮細胞，偶見萎縮的腎小管;術后第14天梗阻側腎臟肉眼觀察:腎臟體積增大，顏色灰白，內有渾濁的尿液，腎皮質變薄，光鏡下可見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質及外髓萎縮的腎小管較多，間質中大量淋巴單核細胞浸潤，纖維化明顯，偶見腎小球硬化。C組與B組平行相比腎小管間質病變程度明顯減輕，腎間質相對面積明顯減少(P＜0．05)。3組比較差異有統計學意義(P ＜0．05)。見表2。

表2 3組腎間質纖維化結果半定量分析n=6，±s

表2 3組腎間質纖維化結果半定量分析n=6，±s

注:與A組比較，*P ＜0．05;與術后3 d比較，#P ＜0．05;與B組比較，△P＜0．05

組別 術后第3天 術后第7天 術后第14天A組0．020 ±0．003 0．021 ±0．005 0．023 ±0．004 B 組 0．323 ±0．014* 0．520 ±0．080*# 0．662 ±0．021*#C 組 0．276 ±0．006＊△ 0．380 ±0．005＊△ 0．455 ±0．004＊△

2．3 免疫組化結果 HGF在腎小管間質A組各時期均幾乎無表達。在B組、C組主要表達于腎小管上皮細胞，腎間質有少量表達，3 d時HGF表達較正常輕度增高，7 d時表達至高峰，14 d時表達減少(P＜0．05)。C組與B組同時相點比較，HGF的表達均增高，組間、組內差異均有統計學意義(P＜0．05)。見表 3。

表3 3組HGF免疫組化結果n=6±s

表3 3組HGF免疫組化結果n=6±s

注:與A組比較，*P ＜0．05;與術后3 d比較，#P ＜0．05;與B組比較，△P ＜0．05

組別 術后第3天 術后第7天 術后第14天A組29±5 26±9 30±7 B組 42±10* 125±7＊△ 35±8＊△C組 51±10*# 144±13*# 52±6*#

3 討論

近年來他汀類藥物的非依賴降脂的腎保護作用被不斷發現，Yamasthita等［2］研究表明，西立伐他汀通過抑制腎纖維化，降低尿蛋白來延緩由高血壓誘導的腎損害。Jandeleit-Dahm等［3］給予5/6腎切除大鼠阿托伐他汀治療12周，在未影響血脂和腎功能的情況下，發現大鼠尿蛋白減少，腎組織中TGF-β基因表達下調，腎小球及腎小管中單核巨噬細胞浸潤減輕。

腎小管間質纖維化是慢性腎臟疾病發展的共同結局。大量形態學定量分析認為它是決定預后的重要因素，其病理過程起初是炎癥期，以淋巴、單核細胞為主的炎細胞浸潤，腎小管變性損傷，繼而腎間質中的成纖維細胞活化，產生大量基質蛋白，間質纖維化［4］。HGF作為近期研究最熱的抑制纖維化因子，在腎臟中作用靶點較多，其可與TGF-β1的互逆作用，進而達到抑制腎小管上皮細胞轉分化(EMT)［5］。本實驗即采用UUO大鼠造成腎間質纖維化，模擬人體內的纖維化過程，研究阿托伐他丁對腎臟的保護作用。UUO術后第3天，腎小管開始擴張，即可觀察到HGF表達增加術后第7天，腎小管明顯擴張，HGF表達明顯增加到術后第14天，HGF表達均明顯下降，并伴有細胞外基質(ECM)大量沉積，腎小管萎縮，刷狀緣脫落，而腎小球基本未受影響。治療組較對照組HGF表達增強。

本實驗研究結果表明HGF在腎間質纖維化的發生、發展中起著重要的作用。在UUO模型中HGF表達顯著增高，抑制了腎間質纖維化，阿托伐他汀促進了HGF的高表達，減輕腎間質炎性細胞浸潤及腎間質纖維化，對腎臟有一定的保護作用。阿托伐他汀對HGF的抑制作用是獨立于降脂之外的。

1 Wynn TA．Cellular and molecularmechanisms of fibrosis．The Journal of Pathology，2007，214:199-210．

2 Yamashita T，Kawashima S，Miwa Y，et al．A 3-hydroxy-3-methylglutarylco-enzyme A reductase inhibitor reduces hypertensive nephrosclerosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats．JHypertens，2002，20:2465-2473．

3 Jandeleit-Dahm K，Cao Z，Cox AJ，et al．Role of hyperlipidemia in progressive renal disease:focus on diabetic nephropathy．Kidney Int，1999，56(Suppl 71):S31-64．

4 Yang L，Liu Y．Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis．JAm Soc Nephrol，2002，13:96-107．

5 郭華，鄒萬忠．腎小管間質纖維化與單核巨噬細胞的關系．北京大學學報，2003，35:503-507．