HPLC-MS/MS測定人體血漿中克拉霉素濃度的方法及方法學確證

張春寶 何世學 何芳 李媛媛 陳剛 高洪志 郝光濤

克拉霉素(Clarithromycin)是大環內酯類抗生素，適用于革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、厭氧菌及支原體、衣原體等非典型病原體所引起的感染。因其吸收后血藥濃度低，有必要建立選擇性好、靈敏的分析方法測定其血藥濃度，研究其臨床藥代動力學［1－6］。國內外對生物樣本中克拉霉素的測定方法有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜聯用法等，但很多方法都存在一定的局限性，如樣本處理過程復雜，色譜條件復雜(梯度洗脫)等，為了研究克拉霉素磷酸酯片的人體藥代動力學，本實驗擬建立高效靈敏準確專屬性強的方法以測定人血漿中克拉霉素濃度。

1 對象與方法

1．1 儀器與試劑 API3200型三重四極桿串聯質譜儀:美國Applied Biosystems公司產品，配有電噴霧離子化源(ESI)，色譜工作站為Analyst1．4．2數據處理軟件 (美國AB公司)，液相色譜儀是島津(SHIMADZU)高效液相色譜系統，包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱。克拉霉素對照品購于中國藥品生物制品檢定所，含量為99．0%，批號:30356-200403;替米沙坦對照品(內標)由北京昭衍新藥研究中心提供，批號:010600160，純度99．5%。甲醇和甲酸均為色譜純，為Dikma公司產品;試驗用水為去離子水，是本實驗室自制;其他試劑為AR試劑。

1．2 溶液的配制

1．2．1 克拉霉素標準溶液的配制:精密稱取克拉霉素對照品10．0 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200．0μg/ml克拉霉素的標準儲備液。

1．2．2 克拉霉素標準溶液的配制:取上述儲備液以甲醇依次倍比稀釋，配成濃度分別為 10、25、100、200、500、1 500 和3 000 ng/ml，即得。

1．2．3 內標(替米沙坦)標準溶液的配制:精密稱取替米沙坦對照品10．0 mg，置于50 m l容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200．0μg/ml的內標儲備液，取該儲備液加入甲醇倍比稀釋至200 ng/ml，作為內標工作溶液，并將其置于4℃冰箱保存待用。

1．3 血漿樣品分析方法 精密量取50μl血漿樣品，置于1．5 ml EP試管中，分別加入50μl內標溶液 (200 ng/ml替米沙坦甲醇溶液)、50μl甲醇，并補加350甲醇溶液，渦旋混合30 s，15 000 r/min 低溫4℃離心 10 min，取上清液進樣 2 μl，進行高效液相色譜-串聯質譜聯法(HPLC-MS/MS)分析。

1．4 色譜及質譜條件

1．4．1 色譜條件:色譜柱:Agilent-XDB-C8柱 (2．1×150 mm，5 μm)，USA; 流動相∶甲醇∶水(含0．1%甲酸)=85∶15(V∶V);流速:0．2 m l/min;柱溫:20℃;進樣量:2 μl。

1．4．2 質譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI源);離子極性:正離子(Positive);離子檢測方式:多反應監測(MRM)方式;噴射電壓:5 500 V;離子源溫度:450℃;源內氣體1(GS1，N2)壓力:40psi;源內氣體2(GS2，N2)壓力:40psi;氣簾氣體(N2)壓力:15psi;碰撞氣(CAD，N2)壓力:5 psi;CE電壓:分別為50 V(克拉霉素)，63 V(替米沙坦，內標);DP電壓(解簇電壓)分別為55 V(克拉霉素)，90 V(替米沙坦，內標);用于定量分析的離子反應對分別為質荷比(m/z)748．4→m/z 158．2(克拉霉素) 和 m/z 515．3→m/z 276．2(替米沙坦，內標)。

2 結果

2．1 質譜分析 取克拉霉素和替米沙坦標準儲備液適量用甲醇稀釋成濃度為100μg/ml的甲醇溶液，按“1．4．2質譜條件”項操作，相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

圖1 克拉霉素和內標替米沙坦的產物離子掃描質譜圖

2．2 特異性 分別取6個不同人的空白血漿50μl，除不加內標溶液并另外補加50μl甲醇外，其余按“3血漿樣品分析方法”項下方法操作，進樣2μl，獲得空白樣品的色譜圖:2-A;將一定濃度的克拉霉素標準溶液和內標替米沙坦溶液加入空白血漿中，依同法進行樣品處理，獲得相應的色譜圖:2-B(最低定量限)、2-C(標準曲線中間濃度)。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾克拉霉素和替米沙坦的測定。

圖2 血漿中克拉霉素和內標替米沙坦的典型MRM色譜圖(Ⅰ克拉霉素;Ⅱ替米沙坦)

2．3 相對基質效應考察 分別取6個不同受試者空白血漿(即受試者0 h血漿)50μl于1．5 m l EP試管中，然后各加入克拉霉素最低濃度(10 ng/ml)標準溶液50μl和內標50μl，按“1．3血漿樣品分析方法”項下操作，進樣量為2μl，每個空白血漿各做3份;并同時做一條隨行的標準曲線，根據標準曲線計算血漿樣品實測濃度。結果顯示所有試驗測定值與標示量的相對偏差 (RE%)均在 ±20%之間，精密度為 5．52(＜15%)，則可認為沒有基質效應干擾。

2．4 血漿中克拉霉素標準曲線制備及定量下限的確定 取人空白血漿50μl，分別精密加入標準系列溶液的克拉霉素對照品溶液50μl和內標溶液50μl，旋渦混勻，配成含克拉霉素的濃度分別為 10、25、100、200、500、1 500 和 3 000 ng/ml的標準含藥血漿，按“3血漿樣品分析方法”項下操作，記錄色譜圖，計算克拉霉素峰面積As和內標峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)。以血漿中待測物濃度(X)為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程(圖3):Y=0．00257X+0．00441，r=0．9989，權重系數w=1/χ2。按上述條件克拉霉素在血漿中的定量下限(LLOQ)為10 ng/ml。配制克拉霉素濃度為10 ng/ml血漿樣品5份，進行HPLC-MS/MS分析，記錄色譜圖，計算克拉霉素峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，按照當日隨行標準曲線方程求得實測濃度及實測濃度準確度，并計算RSD，結果表明所有試驗測定值與標示量的相對標準偏差(RSD%)均在±15%之間。

圖3 HPLC-MS/MS法測定人血漿中克拉霉素的標準曲線

2．5 精密度試驗 取1．5 ml EP試管數支，按“2．4血漿中克拉霉素標準曲線制備及定量下線的確定”項制備含克拉霉素濃度分別為25、400、2 500 ng/ml的標準含藥血漿(每個濃度做6份樣品)及一條隨行標準曲線，按“1．3血漿樣品分析方法”項下操作。每天做一批及一條隨行標準曲線，連續做3 d，共三批，每批每個濃度做6份樣品，記錄色譜圖，計算克拉霉素峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，代入當天的標準曲線求得實測濃度，計算批內和批間精密度。見表1。

表1 HPLC-MS/MS法測定血漿中克拉霉素的批內和批間精密度n=18

2．6 準確度試驗(相對回收率) 取1．5 m l EP試管數支，按“2．4血漿中克拉霉素標準曲線制備”項制備含克拉霉素濃度分別為25、400、2500 ng/ml的含藥血漿，按“3血漿樣品分析方法”項下操作，記錄色譜圖，計算克拉霉素峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，將比值f代入當天的標準曲線方程，計算實測濃度與加入濃度的比值即為準確度(相對回收率)。血漿中低、中、高3個濃度克拉霉素的提取回收率分別為(94．1±8．00)%、(99．6 ±8．20)%、(97．3 ±4．70)%，平均提取回收率為(97．0 ±6．97)%。

2．7 樣品穩定性考察 分別考察:克拉霉素血樣處理后的檢測樣品進樣器中放置4 h穩定性;血漿樣品室溫放置4 h穩定性;血漿樣品－40℃反復凍融3次穩定性;血漿樣品－40℃凍存1個月后穩定性。即制備低、中、高(25、400、2 500 ng/m l)3個濃度的質控樣品，每個方法的每個濃度個3份，按“1．3血漿樣品分析方法”項下操作，每個方法最后所得上清液作為對應0 h的檢測樣品溶液，立即取5μl進樣分析，按照當日標準曲線求出各樣品的濃度，計算各樣品的測得值與實際值的相對偏差(RE%)，與0 h的相應濃度的樣品比較。見表2。

3 討論

HPLC-MS/MS法具有選擇性好、靈敏度高、高通量等優點，目前已被廣泛應用于檢測生物樣本中的藥物以及藥代動力學等研究，而基質效應則是此法測定生物樣本中藥物濃度時十分重要的問題，完整的方法確證應包括對于方法基質效應的研究。采用梯度洗脫的色譜分離方法分析測定時間過于長，影響了方法的測定效率［6－8］。Cherlet指出使用高比例有機相進行洗脫［7］，雖然克拉霉素能較快洗脫出峰，但同時也受到快速洗脫出的基質對其離子化的影響。

本研究建立了測定人血漿中克拉霉素的HPLC-MS/MS法，并進行了系統的方法確證，沉淀蛋白前處理方法簡單快速，優化后的色譜條件極大縮短檢測時間，同時也減少了沉淀蛋白后生物樣本中基質對克拉霉素的影響，實現了高通量測定，本方法靈敏度高，血漿用量僅為50μl，定量下限為10 ng/ml，能夠滿足克拉霉素的人體藥代動力學研究的需要。

表2 各種貯存條件下血漿中克拉霉素穩定性試驗 n=3

1 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(2000年版二部)．北京:化學工業出版社，2000．附錄193-197．

2 李軍，張曉堅，劉廣煉．克拉霉素藥代動力學的研究．數理醫藥學雜志，2000，13:244-245．

3 俞永進．HPLC內標法測定克拉霉素含量．中國藥房，1999，10:137-138．

4 王慶全，張玉國．HPLC法測定克拉霉素顆粒劑的含量．中國抗生素雜志，2002，27:628-629．

5 莫宗琪，吳金虎，裴琳，等．克拉霉素的高效液相色譜法與微生物效價測定法分析比較．中國醫院藥學雜志，2002，22:378-379．

6 Cherlet M，Croubels S，De Backep P．Determination of clindamycin in animal plasma by high-performance liquid chromatography combined with electrospray ionization mass spectrometry．J Mass Spectrom，2002，37:848-853．

7 Yu LL，Chao CK，LiaoWJ，et al．Determination of clindamycin in animal plasma by chromatography-electrospray tandem mass spectrometry:application to the bioequivalence study of clindamycin．JChromatogr B，1999，724:287-294．

8 Li J，Wang N，Zhang ZJ，etal．Pharmacokineticsand bioequivalence study of clindamycin hydrochloride formulations after single-dose administration in healthy Chinese male volunteers．Arzneimitte Forschung，2008，58:358-362．