Plk1、P53、P21WAF1/CIP1 在結(jié)直腸癌發(fā)生中相關(guān)關(guān)系的研究

陳彥杰

Polo-Like激酶1(Plk1)是參與有絲分裂調(diào)控的重要因子，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。人體許多惡性腫瘤中Plk1都存在過度表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。野生型P53是最常發(fā)生突變的抑癌基因，而Plk1被認(rèn)為是腫瘤抑制因子P53的負(fù)向調(diào)節(jié)器，Plk1分子的過剩以及P53分子的短缺將導(dǎo)致腫瘤形成。細(xì)胞增殖抑制基因P21WAF1/CIP1(P21)是P53基因蛋白的下游調(diào)控因子，P53基因突變會(huì)誘導(dǎo)P21蛋白產(chǎn)生減少，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂，而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，引起腫瘤發(fā)生。近年來一系列的體外細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)研究表明三者在細(xì)胞增殖發(fā)生癌變過程中密切相關(guān)，但在體內(nèi)腫瘤蛋白質(zhì)水平上的研究并不多，尤其在結(jié)直腸癌的發(fā)生中，對(duì)于Plk1與P53之間相互關(guān)系的研究國內(nèi)只有1例報(bào)道，P53和P21的相關(guān)性研究結(jié)論并不一致，而三者之間的相關(guān)關(guān)系的研究筆者尚未見國內(nèi)外報(bào)道。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)三者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，在蛋白質(zhì)水平探討它們?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生中的相關(guān)關(guān)系。由于組織中野生型P53的表達(dá)水平很低，半衰期很短，常規(guī)免疫組化方法無法測(cè)出。野生型P53發(fā)生突變后，原有功能消失，新產(chǎn)生的突變型P53半衰期明顯延長(zhǎng)，通過常規(guī)免疫組化方法即可以測(cè)出。因此如果在腫瘤組織中通過免疫組化方法測(cè)出P53的表達(dá)，是突變型P53，P53蛋白陽性表達(dá)表示細(xì)胞中的P53蛋白具有促癌作用或失去抑癌作用。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 收集我院2008年3月至2010年5月結(jié)直腸腺癌標(biāo)本60例，其中男28例，女32例;年齡19～78歲，平均年齡58歲;發(fā)生部位:結(jié)腸癌25例，直腸癌35例;組織分化程度高分化腺癌24例，中分化腺癌20例，低分化腺癌16例。所有患者均為散發(fā)病例，且為初次手術(shù)，術(shù)前未作任何抗腫瘤治療。另選20例正常結(jié)直腸黏膜作為對(duì)照。

1．2 方法 采用MaxVision TM即用型快速免疫組化一步法。鼠抗人Plk1單克隆抗體原液、抗體稀釋液購自美國Santa Cruz公司，稀釋度為1∶80;即用型鼠抗人 P53、P21WAF1/CIP1和MaxVisionTM即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本均用13%甲醛固定，石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，玻片經(jīng)APES防脫處理，常規(guī)脫蠟和水化。染色前經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)法預(yù)處理，抗原修復(fù)液和洗液均采用pH值7．4 PBS緩沖液。一抗室溫孵育1．5 h，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性結(jié)腸癌標(biāo)本做陽性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1．3 判定標(biāo)準(zhǔn) Plk1蛋白表達(dá)主要定位與細(xì)胞漿，間質(zhì)有弱表達(dá);P53和P21蛋白陽性則定位于細(xì)胞核。每張切片選5個(gè)具有代表性的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察免疫組織化學(xué)的染色情況。采用IHS評(píng)分，評(píng)分方法如下:(1)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(記為a):未著色為0分，淡黃色1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)陽性細(xì)胞百分比(記為b):＜5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～80%為3分，81% ～100%為4分。(3)a與b乘積為IHS評(píng)分進(jìn)行半定量分析:0～1為陰性－，2～4分為弱陽性+，5～8分為中度陽性++，9～12分為強(qiáng)陽性+++。陽性定義2～12分，陰性定義0～1分。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Plk1、P53、P21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)情況 Plk1在20例正常黏膜中，陽性表達(dá)3例，陽性率15%，且為弱表達(dá)(+);在60例腺癌中，陽性表達(dá)47例，陽性率78．3%，著色程度弱陽性5例，中度陽性20例，強(qiáng)陽性35例。P53在20例正常黏膜中陽性1例，陽性率5%;60例腺癌中陽性表達(dá)44例，陽性率73．3%，著色程度弱陽性8例，中度陽性17例，強(qiáng)陽性19例。P21在20例正常黏膜中，陽性表達(dá)18例，陽性率90%，弱陽性4例，中度陽性5例，強(qiáng)陽性10例;在60例腺癌中陽性表達(dá)19例，陽性率31．7%，弱陽性7例，中度陽性8例，強(qiáng)陽性4例。見圖1～9。3組與對(duì)照組表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。

2．2 Plk1、P53、P21與臨床病例特征的關(guān)系 本研究組三種蛋白與病例的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes’分期均未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性(P ＞0．05)。

2．3 Plk1、P53、P21蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 結(jié)直腸腺癌中Plk1與P53二者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0．567，P ＜0．05);P53與P21呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0．643，P ＜0．05);Plk1與 P21比較，呈負(fù)(r= －0．599，P ＜0．05);Plk1、P53聯(lián)合表達(dá)與 P21 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0．656，P ＜0．05)。見表 1。

表1 Plk1、P53、P21蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)關(guān)系分析 例

2．4 Plk1、P53聯(lián)合表達(dá)與P21呈負(fù)相關(guān)關(guān)系在腫瘤分化程度的相關(guān)性 5例同陽病例3例出現(xiàn)在低分化腺癌組，占60%，1例出現(xiàn)在中分化腺癌組，占20%，1例出現(xiàn)在高分化腺癌組，占20%。低分化腺癌組與中、高分化腺癌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。但其他表達(dá)方式未發(fā)現(xiàn)有分布差異。

圖1 Plk1在正常黏膜中的陰性表達(dá)(SP×400)

圖2 P53在正常黏膜中的陰性表達(dá)(SP×400)

圖3 P21在正常黏膜中的陽性表達(dá)(SP×400)

圖4 Plk1在結(jié)腸中分化腺癌中的陰性表達(dá)(SP×400)

圖5 P53在結(jié)腸中分化腺癌中的陰性表達(dá)

圖6 P21在結(jié)腸中分化腺癌中的陽性表達(dá)(SP×400)

圖7 Plk1在直腸高分化腺癌中的陽性表達(dá)

圖8 P53在直腸高分化腺癌中的陽性表達(dá)(SP×400)

圖9 P21在直腸高分化腺癌中的陰性表達(dá)(SP×400)

3 討論

細(xì)胞周期與腫瘤的關(guān)系是近年來生命科學(xué)研究中的熱門課題之一，腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病。Plk1是Plk家族中的一員，在細(xì)胞的有絲分裂中起廣泛調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等作用。PLK1的主要功能表現(xiàn)在細(xì)胞周期G2/M交界點(diǎn)轉(zhuǎn)換過程中通過磷酸化下游底物而實(shí)現(xiàn)其功能，阻斷plk1表達(dá)可導(dǎo)致體外腫瘤細(xì)胞分裂停滯及凋亡，Plk1的過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的惡轉(zhuǎn)化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。P53是最常發(fā)生突變的抑癌基因，Yang等［1］關(guān)于P53致癌機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)P53是Plk1的作用靶點(diǎn)之一，Plk1分子通過調(diào)節(jié)Topors磷酸化機(jī)制從而抑制了P53的功能，Plk1的過表達(dá)可以導(dǎo)致P53的突變，抑制P53的抑癌作用，Plk1分子的過剩以及P53分子的短缺將導(dǎo)致腫瘤形成。對(duì)于P53-依賴的轉(zhuǎn)錄激活作用的靶點(diǎn)是細(xì)胞周期蛋白-依賴上激酶抑制因子P21WAF1/CIP1是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，具有阻滯細(xì)胞通過G1/S期的作用，從而抑制細(xì)胞增殖，P53是通過P21發(fā)揮它的功能。所以也可猜測(cè)Plk1是P21的負(fù)向調(diào)節(jié)器［2］。在一項(xiàng)P53缺失的肺癌細(xì)胞H1299的研究中他們發(fā)現(xiàn)外源性Plk1和P53的表達(dá)可以明顯降低P21的轉(zhuǎn)錄，熒光分析也表明Plk1能阻斷P53依賴的內(nèi)源性的P21的誘導(dǎo)作用［2］。可見三者在細(xì)胞增殖發(fā)生癌變過程中密切相關(guān)。

關(guān)于Plk1、P53、P21三者相關(guān)關(guān)系的研究，大多是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)腫瘤蛋白質(zhì)水平上的研究尤其在結(jié)直腸癌中的研究并不多見，研究結(jié)果也不統(tǒng)一。在本研究中Plk1與P53的過表達(dá)、Plk1與P53之間正相關(guān)關(guān)系與文獻(xiàn)［3］結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)Plk1與P21呈負(fù)相關(guān)相關(guān)系，在中高分化腺癌組Plk1、P53聯(lián)合表達(dá)與P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，在低分化腺癌組同陽表達(dá)病例的高比率可能提示三者作用于低分化腺癌的發(fā)生過程中有其他作用因子參與，也可能與選取病例有關(guān)，進(jìn)一步的證明尚需更多研究。本研究證明了Plk1、P53、P21在結(jié)直腸癌發(fā)生中關(guān)系密切，這一結(jié)論為三者在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的相關(guān)作用靶點(diǎn)關(guān)系提供了組織學(xué)依據(jù)，同時(shí)展望在結(jié)直腸腺癌的治療中可以采取從Plk1、P53、P21三個(gè)治療靶點(diǎn)聯(lián)合治療的方法，為更有效的分子靶向治療癌癥研究提供依據(jù)。

1 Yang X，Li H，Zhou Z，et al．Plk1-mediated phosphorylation of Topors regulates p53 stability．JBiol Chem，2009，10:18588-18592．

2 董憲喆，張鵬，畢明剛．絲/蘇氨酸激酶PLK1研究進(jìn)展．中國藥理通報(bào)，2010，26:289-293．

3 Manguila Flavien，許文懷，王智勇．大腸癌中P53和P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)及其意義．北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，33:582．