Toll樣受體 4在腦梗死損傷中的作用及其與 TNF-α的動態相關性研究

奉俊敏,郭 偉,李少明

(廣州醫學院第一附屬醫院神經內科,廣東 廣州 510120)

腦梗死缺血性損傷機制錯綜復雜,其中炎性損傷機制研究備受矚目,各種炎性細胞的激活,細胞因子、炎性遞質的釋放,共同造成或加重缺血性損傷,而炎性受體的表達及激活是關鍵環節之一。Toll樣受體 4(Toll-like Receptor4,TLR4)作為跨膜信號轉導受體,最初被認為介導細菌內毒素(LPS)誘導的炎癥反應,但隨著研究的深入,發現 TLR4參與腦缺血再灌注炎性損傷[1-2]。試驗證實腦梗死急性期TLR4表達上調,血清炎性因子顯著升高[3],但兩者在腦梗死病程中的動態相關性研究,國內外少見文獻報道。本文運用 RT-PCR法、ELISA法測定腦梗死發病第 1天、第 2天、第 7天外周血單個核細胞(淋巴細胞、單核細胞)TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度,進一步探討 TLR4在急性腦梗死缺血炎性損傷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 于 2009年 1月至 2009年 9月,收集在發病第 1天內收住廣州醫學院第一附屬醫院神經內科的急性腦梗死患者 35例,動態觀察 7 d,對其進行發病第 1天、第 2天、第 7天三個時間點的外周血淋巴細胞、單核細胞 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α水平動態測定。所有病例均符合 1995年全國第四屆腦血管病學術會議制定的診斷標準,并且入院 3 d內經 MRI證實。有下列情況之一者排除:(1)發病前兩周有炎性病變史或住院時發生感染性疾病者;(2)急性心肌梗死者;(3)急性肝缺血病變者;(4)自身免疫性疾病者;(5)使用激素或免疫抑制劑者;(6)不依從或不能完成本課題涉及指標測定者。收集同期性別年齡匹配的廣州醫學院第一附屬醫院老年科體檢健康者 20例作正常對照組;收集同期性別年齡匹配的來廣州醫學院第一附屬醫院就診的腦動脈粥樣硬化患者和(或)冠狀動脈粥樣硬化患者 20例作動脈粥樣硬化組。

1.2 試劑與儀器 Trizol(intrivogen公司),M-MuLV逆轉錄酶(200 U/μl)、Olig(dT)18、RNA酶抑制劑 (20 U/μl)、10 Mm dNTPMix、5×反應 Buffer(MBI公司 ),DNaseⅠ 、Taq DNA Polymerase、PCR Mark(大連寶生物工程有限公司),DEPC(Sigma公司),引物(上海博亞生物公司),人 TNF-αELISA試劑盒(北京晶美試劑公司),其他試劑均為國產分析純。PCR熱循環儀(Techne公司),全自動紫外分光光度儀(Perkin Elmer公司),電泳凝膠圖像分析儀(Tanon公司),高速低溫離心機(Universal公司)。

1.3 標本處理 取禁食 12 h以上清晨空腹肘靜脈血 8 ml,6 ml靜脈血肝素(50 U/ml靜脈血)抗凝,搖勻,選用 Ficoll分層液法分離得到單個核細胞,2 ml靜脈血不抗凝,室溫下凝固后分離血清,-20°C下冷凍保存備用。

1.4 RT-PCR 總 RNA按照 intrivogen公司試劑盒說明書進行抽提與純化,并經 DNaseⅠ處理。逆轉錄反應按照 MRI公司試劑盒說明書進行。TLR4引物設計參照 Helen等[4]文獻,上游引物為:5′TGGATACGTTTCCTTATAAG 3′;下游引物為 :5′GAAATGGAGGCACCCCTTC 3′。 TLR4的 PCR擴增片斷為 507 bp。內參為 β-actin,內參引物由上海博亞生物公司設計,上游引物為:5′GGGACCTGACTGACTACCTCAT 3′;下游引物為 :5′CAAGAAAGGGTGTAACGCAAC 3′。 β-actin的 PCR擴增片斷為610 bp。TLR4與內參 β-actin同管擴增,PCR反應條件為:預變性 :94°C 5 min;循環 28次:95°C 45 s,54°C 45 s,72°C 60 s;終末延伸 :72°C 10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及半定量 取 PCR產物5μl,加 6×載樣緩沖液 1μl,在含有 0.5μg/ml EB的 1.2%瓊脂糖凝膠中電泳 55 min,恒壓 110 V。凝膠圖像分析系統測量出 TLR4、β-actin的平均光密度值,兩者的比值作為衡量 TLR4 mRNA表達高低的相對值。

1.6 血清 TNF-α濃度測定 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法,按照晶美公司人 TNF-αELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.7 腦梗死患者梗死體積計算 35例腦梗死患者均在發病 3 d內行頭部 MRI檢查,根據 MRI(DWI序列)結果,采用多田公式計算腦梗死體積(腦梗死體積 =π/6×長 ×寬 ×MRI陽性掃描層數×層厚),由兩名放射科醫生分別進行,取其平均值。

1.8 腦梗死體積分組 依據發病第 3天腦梗死體積大小將 35例腦梗死患者分為三組[5],≤4 cm3為小梗死組,＞4 cm3、＜10 cm3為中梗死組,≥10 cm3為大梗死組。

1.9 統計學處理 實驗測定的計量資料數值用均數 ±標準差(x±s)表示。多個獨立樣本均數間的兩兩比較用 one-way ANOVA及基于此的 q檢驗,TLR4 mRNA與 TNF-α的相關性用 pearson相關分析。以 P值 ＜0.05為差異有統計學意義。所有數據使用 SPSS11.5軟件包進行統計分析。

2 結 果

2.1 腦梗死組(第 3天)、動脈粥樣硬化組、正常對照組中的外周血單個核細胞 TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度比較見表 1。

TLR4 mRNA、血清 TNF-α在腦梗死組的水平明顯高于動脈粥樣硬化組和正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 腦梗死組(第 3天)、動脈粥樣硬化組、正常對照組中的TLR4 mRNA表達水平及血清 TNF-α濃度比較(x±s)

2.2 腦梗死組(第 3天)外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與血清濃度 TNF-α呈正相關,相關系數為 0.846(P＜0.01)。

2.3 不同腦梗死體積組的外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度差異比較見表2。

腦梗死三組之間,TLR4 mRNA表達水平及血清TNF-α濃度差異有統計學意義(P＜0.01),腦梗死體積越大,TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度越高。

表2 不同腦梗死組中的 TLR4 mRNA表達及血清TNF-α濃度比較(x±s)

2.4 腦梗死患者 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α水平動態變化。在發病 24 h內入院并連續完成三個時間點觀察的急性腦梗死患者 35例,對其進行周圍血淋巴細胞和單核細胞的 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α濃度動態變化觀察,時間點依次為第 1天、第 3天、第 7天,結果表明:

(1)腦梗死患者的 TLR4 mRNA動態表達大致呈上升趨勢 (見表 3、圖 1、圖 3)。第 1天的 TLR4 mRNA表達與第 3天、第 7天的 TLR4 mRNA表達水平比較差異有統計學意義,第 3天的 TLR4 mRNA表達水平與第 7天的 TLR4 mRNA表達相近,差異無統計學意義。發病第 1天 TLR4 mRNA與正常對照組相比,即有明顯升高趨勢(上升 1.71倍),第 3天大幅度上調至高表達水平,第 7天與第 3天的表達水平大致呈平臺期。

(2)腦梗死患者的血清 TNF-α動態濃度亦呈上升趨勢(見表 4、圖 2)。第 1天的血清 TNF-α濃度與第 3天、第 7天的血清 TNF-α濃度比較,差異有統計學意義,第 3天的血清 TNF-α濃度與第 7天的血清 TNF-α濃度比較差異有統計學意義。血清 TNF-α濃度在發病第 1天比正常組略有升高(上升 0.81倍),第 3天呈大幅度升高趨勢,第 7天的血清 TNF-α濃度最高。

表3 腦梗死組患者第 1天、第 3天、第 7天的動態 TLR4 mRNA表達及與正常對照組、動脈粥樣硬化組比較(x±s)

表4 腦梗死組患者第 1天、第 3天、第 7天的動態 TNF-α水平及與正常對照組、動脈粥樣硬化組比較(x±s)

圖1 腦梗死患者的第 1天、第 3天、第 7天動態TLR4 mRNA表達變化及與正常對照組、動脈粥樣硬化組的比較

圖2 腦梗死患者的第 1天、第 3天、第 7天動態血清 TNF-α濃度變化及與正常對照組、動脈粥樣硬化組的比較

圖3 發病第 1天、第 3天、第 7天不同時間點與正常對照組、動脈粥樣硬化組的 PCR產物1:正常對照組2:動脈粥樣硬化組3:發病第 1天患者 507bp處為 TLR 4擴增產物4:發病第 3天患者 610bp處為 β-actin擴增產物5:發病第 7天患者

3 討 論

腦梗死后壞死及缺血區域因急性缺血而觸發炎性瀑布反應,導致過度的炎性損傷,成為神經元死亡的重要機制之一。TNF-α是腦缺血炎性損傷機制中的重要效應因子。本試驗對急性腦梗死病程的動態觀察研究表明:TNF-α在腦梗死急性期(7 d內)呈上升趨勢,第 7天最高;而且,梗死面積越大,血清TNF-α濃度越高;腦梗死體積與血清 TNF-α呈正相關。提示 TNF-α在缺血病理損傷機制中發揮著強大的致炎作用。但 TNF-α僅是炎性損傷機制鏈條末端的效應環節,它的上游啟動環節及促使它被產生、分泌的始發因素值得進一步去探索。

Toll樣受體(TLRs)是一個介導天然免疫的古老家族,是歷經數億年演化而仍然保存的宿主防御機制之一。自 1998年 Poltorak等[6]發現了 TLR4以來,其作為炎性跨膜受體在感染性疾病研究領域中已是熱點。然而,近年來 TLR4基因敲除鼠的缺血模型實驗[7-9]表明:TLR4參與心肌、肝臟缺血炎性損傷機制,并與炎性因子的產生緊密相關。本試驗結果表明 TLR4 mRNA在腦梗死組中的表達上調,TLR4 mRNA在腦梗死患者組的表達水平明顯高于動脈粥樣硬化組和正常對照組,腦梗死體積越大,TLR4 mRNA表達越高。腦梗死體積與周圍淋巴、單核細胞 TLR4 mRNA表達呈正相關。

TLR4在外周血淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞膜上表達豐富。中樞神經系統表達 TLR4的主要細胞是小膠質細胞[10],它在炎性狀態下被激活后發揮強有力的致炎作用,TLR4是小膠質細胞執行免疫功能作用的關鍵信號轉導受體之一[11]。同時在腦血管內皮細胞、軟腦膜、脈絡叢、穹隆下器、終板的血管性器官及正中隆起、最后區等處也發現表達[12]。而腦缺血病理損傷中小膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞是 TNF-α產生分泌的主要來源之一[13]。腦梗死時,缺血缺氧所促發的血管內皮通透性改變,腦組織壞死物質的釋放,吸引外源性的單核/巨噬細胞、淋巴細胞趨化、聚集,成為加劇炎性損傷的效應細胞,這些細胞均有豐富的TLR4表達。基于上述認識,可以認為 TLR4 mRNA表達和 TNF-α產生、分泌均源于相同的細胞,有共同的物質基礎。

本實驗對 35例 24 h入院的急性腦梗死患者外周血淋巴細胞、單核細胞的 TLR4 mRNA表達及血清TNF-α濃度進行第 1天、第 3天、第 7天的動態觀察,兩者在急性期均呈上升趨勢,而 TLR4 mRNA的表達在發病的第 1天即明顯升高,血清 TNF-α濃度僅略比正常組高;第 3天 TLR4 mRNA表達達到較高水平時,TNF-a的濃度才呈大幅度的上升趨勢;第 7天 TLR4 mRNA持續在高水平的平臺期時,TNF-α仍在繼續升高,并且達到 7 d內的最高值。盡管我們僅對腦梗死急性期 7 d內的有限三個時間點做了粗略動態觀察,不能推測第 7天后 TLR4 mRNA表達和 TNF-α濃度的升降,但該結果仍然體現了兩者上升的大致變化輪廓。急性腦梗死患者外周淋巴細胞、單核細胞的 TLR4 mRNA表達變化規律目前在國內外少見報道。第 3天的 TLR4 mRNA表達與TNF-α濃度相關性研究顯示:兩者呈正相關,具有統計學意義。上述結果提示 TNF-α的產生、分泌可能與 TLR4 mRNA表達存在著密切聯系。已有研究[14]證實內毒素血癥模型的 TLR4基因缺陷鼠心肌中 TNF-αmRNA表達缺如,而正常鼠心肌中 TNF-αmRNA表達迅速增高,兩者的表達差異,揭示了TLR4與炎癥因子 TNF-α之間的因果關系。TLR4作為重要炎性受體,介導炎性損傷,其機制[15]可能為啟動胞內信號轉導,通過 NF-κB(核因子 -κB)和 JNK(c-Jun氨基末端激酶)/SAPK(應急激活蛋白激酶)兩條途徑,激活炎性細胞,導致炎性因子:IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、NO、PAF、PGs和粘附分子等的大量表達,觸發一系列炎性反應。而上述炎性因子也正是腦缺血炎性損傷中的效應分子。由本試驗中 TLR4 mRNA表達和 TNF-α濃度的動態變化趨勢可知:第 3天 TLR4 mRNA表達已達較高水平,TNF-α濃度第 7天才達最高,時間上滯后于TLR4 mRNA。由此推測:在腦缺血損傷炎性病機制中,TLR4 mRNA表達增加有可能是 TNF-α產生、分泌增多的上游啟動環節,從而參與介導腦缺血炎性損傷。

當然,TLR4促使 TNF-α產生、分泌僅是 TLR4強大炎性機制中的一部分,TLR4的表達及功能狀態與炎性損傷程度存在緊密聯系。如果在合適的時間窗內能從 TLR4的水平阻斷其下游炎性瀑布效應,將會有效遏制腦缺血炎性損傷。TLR4既是人體的天然免疫防御機制,又參與過度炎性損傷。探索TLR4在急性腦梗死缺血炎性損傷中的作用機制,將為臨床提供治療靶點。

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