發酵谷物中產L-賴氨酸益生菌的篩選與鑒定

駱超超，高學軍*，王青竹，于 微，劉曉飛，盧志勇，喬 彬

發酵谷物中產L-賴氨酸益生菌的篩選與鑒定

駱超超，高學軍*，王青竹，于 微，劉曉飛，盧志勇，喬 彬

(東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了擴展高產L-賴氨酸菌種在食品、飼料中的應用與提高微生物發酵生產L-賴氨酸的安全性，從面包、麻花、饅頭、發面餅、大列巴、黏豆包發酵谷物的生面團及米酒、白酒曲中分離培養出66株產L-賴氨酸益生菌菌株。將這些菌株進行培養、發酵，并利用高效液相色譜技術檢測其發酵液中L-賴氨酸的含量，篩選出發酵液富含L-賴氨酸的菌種兩株。最后利用16S rDNA分析及Blast分析、特異性引物PCR技術鑒定出這兩株菌為腸膜明串球菌ATCC 8293和德氏乳桿菌ATCC BAA-365。其發酵液中L-賴氨酸含量分別為52.33、46.09g/L，較其他菌種相對較高。

發酵谷物；L-賴氨酸；益生菌；高效液相色譜；16S rDNA；PCR

賴氨酸(lysine)的化學名稱為2,6-二氨基己酸，有L-型、D-型和DL型3種異構體。L-型賴氨酸是人和動物所必需的氨基酸之一。它對調節體內代謝平衡，提高體內對谷類蛋白質的吸收，改善人類膳食營養和動物營養，促進機體生長發育均有重要作用[1]。L-賴氨酸的生產方法有：微生物發酵法、化學合成法、抽提法等。目前，最常用的發酵生產L-賴氨酸的菌株主要是棒狀桿菌和短桿菌等細菌的變異株，棒狀桿菌已經發展為具有極高經濟價值的菌株[2]，其中以應用谷氨酸棒狀桿菌最為廣泛[3]。此外，L-賴氨酸生產還有應用大腸桿菌[4]、甲基營養嗜甲基菌[5]、胚芽乳桿菌[6]等菌種的報道。但目前所使用的高產L-賴氨酸菌種大多為有害菌種，而在益生菌中篩選高產L-賴氨酸菌種方面的研究還比較少，這大大的限制了其在食品及飼料添加劑中的應用。為了擴展高產L-賴氨酸菌種在食品、飼料中的應用與提高微生物發酵生產L-賴氨酸的安全性，本實驗從常見的幾種發酵谷物中分離培養產L-賴氨酸益生菌株菌，利用高效液相色譜檢測技術，篩選其發酵液中L-賴氨酸含量較高的菌株，以期為高產L-賴氨酸菌種的篩選及誘變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

面包、麻花、饅頭、發面餅、大列巴、黏豆包發酵谷物的生面團及米酒、白酒曲購于哈爾濱香坊農貿市場。

L-賴氨酸標準品(色譜純)；0.8mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH9.0)；含體積分數25%甲醇的0.01mol/L NaAC緩沖液(冰乙酸調節pH值至5.20，經0.45mm微孔濾膜真空超濾，并超聲波脫氣)；30mg/mL 2,4-二硝基氯苯(CDNB)溶液(臨用時新配)；基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購于北京天根試劑公司；引物1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3')、引物2(5'-AAGGAGGTG ATCCAGCCGCA-3')、10×Buffer、dNTP、ExTaq、D2000的Marker、PCR所用試劑均購于大連寶生物公司。

日本島津SPD-10AV高效液相色譜儀；C18不銹鋼分離柱YMC(4.6mm×150mm，5μm)；DZF-6030B型真空干燥箱；微型漩渦混合儀。

1.2 培養基

基礎培養基：葡萄糖5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 2.5g，加蒸餾水配至1L，pH值調至7.2～7.4，固態基礎培養基加瓊脂15～20g/L；麥芽汁培養基：稀釋麥芽汁到10～12°B é，固態則加15～20g/L 的瓊脂。以上培養基均121℃高壓滅菌15min。發酵培養基：葡萄糖15.0g、(NH4)2SO43.5g、CaCO34.0g、MgSO4·7H2O 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.15g、玉米漿 2.5g、蒸餾水100mL，pH7.0～7.2，115℃高壓滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離

無菌取面包發酵前生面團10g溶于90mL鹽-蛋白胨稀釋液(每升液體中加NaCl 8.5g、蛋白胨 1.0g調pH6.0)中。取50mL于4℃，200×g離心5min，取上清液，再次于4℃，5000×g離心15min，棄上清液，將細菌沉淀懸浮于2mL液態基礎培養基中，取細菌懸液劃平板接種于固態基礎培養基中，27～35℃培養[7]，24～72h后，挑各種不同單個菌落接種至液態培養基，27～35℃培養。培養基變渾濁后再接種至固態培養基，如此反復至平板中菌落單一。然后挑出單一菌落，革蘭氏染色、鏡檢，若菌種純化后則將菌種液態培養至培養基變渾濁，菌液與40%的滅菌甘油1:1混合，置于－80℃凍存。

麻花、饅頭、發面餅、大列巴、黏豆包等發酵谷物的生面團菌種分離培養同上。白酒曲取樣同上，培養基換為麥芽汁培養基，培養溫度為25℃。米酒菌種取樣：將米酒樣混勻，無菌取適量(培養基量的2%左右)接種至液態麥芽汁培養基中，25℃培養至菌液變渾濁。用接菌環劃平板接種至固態培養基，分離至單一菌種后同上操作。

1.3.2 發酵樣品液的制備

將1.3.1節分離得到的菌種分別單獨接種至發酵培養基中。30℃、120r/min，搖床培養48h。取發酵液1mL，按照GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》[8]中酸水解法進行水解。水解后，冷卻，混勻，開管，過濾，用蒸餾水反復沖洗試管和濾紙，定容至50mL。吸取5mL濾液，置真空干燥箱中60℃抽真空，蒸發至干燥，用2mL三蒸水溶解，得到發酵樣品液。

1.3.3 L-賴氨酸標準樣品的衍生

L-賴氨酸標準樣品的衍生方法參見文獻[9]。標準樣品的質量濃度分別為：2、5、 10、20、40、60、80、100、120μg/mL。

1.3.4 發酵樣品液的衍生

吸取發酵樣品液1mL，分別置于50mL具塞離心管中，再吸取pH9.0 Na2CO3-NaHCO3緩沖液2mL，混勻后，加入CDNB溶液1.5mL，混勻，其他步驟同1.3.3節。

1.3.5 色譜條件

本實驗色譜條件參見文獻[9]。

衍生后的試劑經0.22μm濾膜過濾后直接上樣，體積10μL，測定其中L-賴氨酸含量。

1.4 菌種的鑒定

1.4.116 S rDNA分析

對1.3節中篩選出的產L-賴氨酸的菌種進行16S rDNA分析，菌種鑒定：用細菌基因組DNA提取試劑盒提取所選菌種的DNA。然后用細菌通用引物：引物1 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'；引物2 5'-AAGGAGGTG ATCCAGCCGCA-3'進行PCR擴增[10]。PCR體系：25μL體系，10×Buffer 2.5μL、dNTP 2.0μL、模板DNA1.0μL、引物11μL、引物21μL、ExTaq 0.25μL、滅菌蒸餾水17.25μL。PCR條件：94℃預變性5min；在94℃變性30s，61～65℃退火30s，72℃延伸1min并循環30次；最后72℃終延伸10min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，回收產物送上海英俊生物科技有限公司測序。

1.4.2 特異性引物PCR分析

根據16S rDNA分析結果，以腸膜明串球菌的特異性引物5'-TTTATGGTGGGGTTGGTCTT-3'，5'-TTTTGGTCGTGGCATGTAGTA-3'；德氏乳桿菌保加利亞亞種的特異性引物5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'，5'-CTTGTACACACCGCCCGTCA-3'，分別對兩種菌進行PCR擴增，PCR體系同1.4.1節條件：兩種菌退火溫度分別為56.9、55.0℃，其余同1.4.1節。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 菌種分離培養的結果

本實驗從發酵谷物中分離獲得66株菌，分別從大列巴中分離13種(以A標記)，饅頭中分離7種(以X標記)，面包中分離7種(以O標記)，麻花中分離11種(以T標記)，發面餅中分離9種(以F標記)，黏豆包中分離8種(以N標記)，米酒中分離4種(以M標記)，白酒曲中分離7種(以B標記)。

2.2 發酵液中L-賴氨酸含量檢測結果

2.2.1 L-賴氨酸標準樣品衍生后峰形的鑒別

圖1 80μg/mLL-賴氨酸標準品衍生液HPLC圖Fig.1 HPLC profile of standardL-lysine solution (80μg/mL) after derivatization

圖1中從左邊起第1個峰為CDNB在堿性條件下形成的DNP-OH，第2個峰為經CDNB衍生生成的DNPL-賴氨酸，為目的峰，出峰時間為14.585min，第3個峰是衍生化過程中產生的2,4-二硝基羥乙基苯(DEB)的峰[9-11]。

2.2.2 L-賴氨酸衍生后標準曲線的建立

以進樣質量濃度對所得峰面積作直線回歸，得回歸方程：y=0.0003x＋2.3725。在進樣量為2～120μg/mL的范圍內，經重復進樣，R2均在0.9998，在此范圍內進樣濃度與峰面積呈良好的線性相關性。

2.2.3 細菌發酵液中L-賴氨酸含量的測定

從表1可看出，從米酒與白酒曲中分離出的菌種發酵液中L-賴氨酸含量普遍較低，除白酒曲中有兩種菌發酵液中L-賴氨酸含量超過10g/L以外，其余均低于10g/L。而從饅頭、面包、麻花、黏豆包、大列巴等面食發酵物中分離出的菌種發酵液中L-賴氨酸含量大部分較高，除極個別幾種菌以外，其發酵液中L-賴氨酸含量均在20～60g/L之間。本實驗選出發酵液中L-賴氨酸含量較高的株菌為：X7、T2、A7、N3，其L-賴氨酸含量分別為：52.33、52.30、49.32、46.09g/L。

2.3 菌種的鑒定結果

2.3.116 S rDNA分析結果

圖2 4種菌種非特異性PCR擴增結果Fig.2 Results of non-specific PCR amplification of 4 screened strains with higher ability to produceL-lysine

表1 66種菌發酵液中L-賴氨酸含量Table 1 L-lysine contents in fermentation broths of 66 isolated strains

用細菌通用引物對所選的4種菌進行非特異性PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2。

由圖2可見， 4個菌種樣品均在1500bp處有目的條帶。將4種菌種非特異性PCR擴增結果用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并測序。將測序結果在NCBI上進行Blast分析得X7、T2與Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(CP000414.1)的同源性為

100%，從而初步確定X7與T2為同一菌種，均為腸膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293)；A7與Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168(AL009126.3)的同源性為100%，初步確定其為Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168(因Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168不是益生菌，故在下面的實驗中被排除)；N3與Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365(CP000412)的同源性為100%，初步確定其為德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365)。

2.3.2 特異性PCR結果分析

以X7/T2、N3的特異性引物進行PCR擴增，產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3～4。

圖3 X7菌種的特異性PCR結果Fig.3 Results of specific PCR amplification of strain X7

圖4 N3菌種的特異性PCR結果Fig.4 Results of specific PCR amplification of strain N3

由圖3可見，X7菌種在828bp處有特異性條帶；由圖4可見，N3菌種在250bp處有特異性條帶，這與16S rDNA分子鑒定結果一致，進一步證明了鑒定結果的正確性。

3 結 論

L-賴氨酸是人和動物營養的8種必需氨基酸中的第一必需氨基酸。并且，它不能在人與動物體內由還原氨基化作用或轉氨基作用生成，必須由食物中攝取，因此L-賴氨酸有“特殊必需氨基酸之稱”[12]。在畜牧水產業方面，L-賴氨酸對豬[13-14]以及各種魚類[15-16]的生長發育均有重要作用。此外，L-賴氨酸還是幼牛生長發育的第一限制性氨基酸[17-18]，并且，它在提高奶牛奶產量及改善乳成分方面也有重要作用[19-20]。

本實驗從北方常見的幾種發酵谷物中分離得到66株菌，然后利用高效液相色譜法測定它們的發酵液中L-賴氨酸含量，從饅頭、黏豆包、大列巴等面食發酵物中選出兩種發酵生產L-賴氨酸相對較高的菌株，它們分別是腸膜明串球菌 ATCC 8293、和德氏乳桿菌ATCC BAA-365。這可能與從饅頭等幾種面食發酵物中分離出的菌種以乳酸菌種屬的菌種為多有關，這說明在發酵產生L-賴氨酸方面，乳酸菌有較強的能力。這些菌種發酵高產L-賴氨酸條件的優化及通過生物技術手段進一步提高其發酵生產L-賴氨酸的能力待進一步研究。

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Screening and Identification of L-lysine-producing Probiotics

LUO Chao-chao，GAO Xue-jun*，WANG Qing-zhu，YU Wei，LIU Xiao-fei，LU Zhi-yong，QIAO Bin
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The present study aimed to expand the utilization of L-lysine-producing strains in food and animal feeds and raise the security of L-lysine production by microbial fermentation. In total, 66 strains having the ability to produce L-lysine were isolated from commercially available doughs for the making of bread, fried dough twists, steamed bread, steamed cake and Russian style bread and kojis for the making of rice wine and distilled liquor. These strains were cultured, and the quantitation of L-lysine content in medium at the end of culture was carried out using HPLC. Two of the 66 isolated strains were found to produce higher amount of L-lysine and the contents of L-lysine in the resultant fermentation broths were 52.33 g/L and 46.09 g/L respectively. Using 16S rDNA sequence and Blast analyses and specific primer PCR technique, they were identified as Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293 and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365.

fermented cereals；L-lysine；probiotics；high-performance liquid chromatography；16S rDNA；specific PCR

Q93.331

A

1002-6630(2010)21-0232-04

2010-01-14

黑龍江省科技計劃項目(GAO7B401-5)

駱超超(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為菌種分離與鑒定。E-mail：luochaochao839505@163.com

*通信作者：高學軍(1969—)，男，教授，博士，研究方向為乳業科學與食品工程。E-mail：gaoxj5390@sina.com