固態(tài)發(fā)酵菜籽肽功能特性研究

鞠興榮，何海艷，何 榮，王立峰,，袁 建

(1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

固態(tài)發(fā)酵菜籽肽功能特性研究

鞠興榮1，何海艷1，何 榮2，王立峰1,2，袁 建1

(1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

研究固態(tài)發(fā)酵制備菜籽多肽的功能特性，同時與菜籽蛋白功能特性進(jìn)行比較。結(jié)果表明，發(fā)酵菜籽肽具有良好溶解性，在pH2.0～12.0范圍內(nèi)，保持較高的氮溶解指數(shù)(NSI＞85%)，而菜籽蛋白在pH8.0以下會凝聚沉淀；在20～80℃溫度范圍內(nèi)，菜籽蛋白的吸水力和吸油力變化不大，而發(fā)酵菜籽肽的吸水力和吸油力則隨著溫度的升高而降低；在2～5g/100mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菜籽肽的乳化性優(yōu)于菜籽蛋白；發(fā)酵菜籽肽也具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，但是不具有凝膠性；另外，在0～500μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菜籽肽對DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度成線性相關(guān)(R2=0.9912)，IC50為328μg/mL。

固態(tài)發(fā)酵；菜籽肽；功能性質(zhì)

Abstract：The functional properties of rapeseed peptides (RSP) derived from solid-state fermentation were studied and compared with those of rapeseed protein (RP) in this work. The results showed that in comparison with RP, RSP had a better solubility and could keep a high NSI over 85% at a wide range of pH 2.0 to 12.0, while RP had a worse solubility when the value of pH was lower than 8.0. Neither the water-binding nor oil-binding capacities of RP had an obvious change at a varying temperature between 20℃ and 80 ℃, while those of RPS decreased as temperature increased. RSP also showed better emulsifying capacity in a large concentration range (2 to 5 g/100mL) when compared with RP. At the same time, RSP had better foaming capactiy and foam stability but had worse gel properties. Besides, RSP had the ability to scavenge DPPH free radicals, which was positively linearly correlated with concentration over a range from 0 to 500μg/mL (R2=0.9912), and the IC50 was 328μg/mL.

Key words：solid-state fermentation；rapeseed peptides；functional properties

所謂功能特性是指蛋白、肽在配制、加工、儲藏和制取過程中的理化性質(zhì)，包括溶解性、吸水力、乳化性、吸油力、黏度、膠凝性和起泡性等[1]，其功能特性的優(yōu)劣取決于蛋白質(zhì)、肽本身的大小與結(jié)構(gòu)、環(huán)境因素(濃度、pH值、離子強(qiáng)度等)以及其他成分(水、糖、氣味等)的存在[2]。菜籽蛋白質(zhì)水解得到的多肽不僅具有良好的酸溶性、低黏度、抗凝膠形成性，而且在體內(nèi)消化吸收快，蛋白質(zhì)利用效率高[3]；低分子質(zhì)量的菜籽肽具有低抗原性，不會產(chǎn)生過敏性反應(yīng)；低分子質(zhì)量的肽具有良好的生理活性，如抗氧化、抗腫瘤等生物活性[4-5]，可作為運(yùn)動營養(yǎng)劑、老年食品等。

本研究通過與堿溶酸沉工藝制備得到的菜籽分離蛋白進(jìn)行比較，研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵得到的菜籽肽的功能特性，為發(fā)酵菜籽肽在食品中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽分離蛋白，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.55%(干基，N×6.25)；發(fā)酵菜籽肽，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.3%(干基，N×6.25)，實(shí)驗(yàn)室自制[6]。

2,2-二苯基-1-苦味肼基(DPPH)、抗壞血酸(VC)、α-生育酚(VE) Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密數(shù)顯pH計、722N紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；數(shù)顯高速剪切乳化機(jī) 上海磨具廠；ALpHA2-4 型真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菜籽多肽的制備

從活化后的菌種保藏斜面中挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35℃、120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體達(dá)到108個/mL。按3×107個/mL的接種量將液體種子接入已滅菌的無菌水中，無菌水中事先加入葡萄糖(0.26g/100mL )和KH2PO4(0.26g/100mL)，調(diào)pH值為7.0，即得發(fā)酵劑[7]。

將菜籽粕粉碎至顆粒徑大小為500μm，滅菌，按固液比1:2加入發(fā)酵劑，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為32℃，環(huán)境濕度為90%，定時攪拌通風(fēng)，發(fā)酵3d后取樣，按固液比1:15加蒸餾水溶解發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌30min，5000×g離心15min，取上清液真空濃縮，冷凍干燥得菜籽肽粉，備用。

1.3.2 菜籽蛋白、肽凝膠的制備

Li等[8]的方法，并略作改進(jìn)。取一定量菜籽蛋白和菜籽肽，溶于0.1mol/LNaCl溶液中，配制成質(zhì)量濃度為15g/100mL、pH7.5溶液，磁力攪拌2h，使菜籽蛋白、肽充分溶解。取10mL已溶解的菜籽蛋白、肽于10mL小燒杯中，置于50℃的水浴中，保溫30min，取出置于95℃的水浴中，保溫15min，然后將其置于4℃的冰箱中存放24h，取出陳化30min，研究菜籽蛋白、肽的凝膠性。

1.3.3 菜籽肽溶解性的測定

采用凱氏定氮法測定。稱取菜籽蛋白和菜籽肽各0.5g，溶解于50mL不同pH值(2～l2)的緩沖溶液中(0.05mol/L)，室溫下磁力攪拌30min，2000×g離心20min，取上清液，按公式(1)計算溶解度。

1.3.4 菜籽肽吸水力的測定

參照參考文獻(xiàn)[9]測定。取10mL離心管，稱質(zhì)量(m1)。準(zhǔn)確稱取干質(zhì)量(m0)0.5g菜籽蛋白質(zhì)或肽于離心管中，加蒸餾水2mL，用細(xì)鐵絲攪動均勻，成稀糊狀。將裝有蛋白質(zhì)溶液的離心管置于水浴鍋中45℃保溫30min，取出于冰水浴中冷卻30min。2000×g離心20min，去除上清液，稱離心管質(zhì)量(m2)，按公式(2)計算吸水力(WHC)。

1.3.5 菜籽肽吸油力的測定

參照參考文獻(xiàn)[10]測定。稱取0.5g菜籽蛋白質(zhì)或肽于10mL離心管中，加入3mL大豆色拉油，磁力攪拌5min，分別于25、45、65、85℃水浴中保溫30min，2000×g離心20min，吸去上層未吸附油，稱質(zhì)量。按公式(3)計算吸油能力。

式中：m0為樣品的質(zhì)量/g；m1為樣品的質(zhì)量+離心管的質(zhì)量/g；m2為吸油后樣品質(zhì)量+離心管的質(zhì)量/g。

1.3.6 菜籽肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

參照Pedroche等[11]方法測定。稱取0.2g菜籽蛋白質(zhì)、肽，溶解于20mL pH7.0的緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為1g/100mL的溶液，室溫磁力攪拌30min后，于乳化分散機(jī)中10000r/min分散1min，將樣品全部轉(zhuǎn)移至25mL量筒內(nèi)，計下泡沫的高度(h0，0min)，靜置l0、30、 60、 90、120min后，分別測定泡沫的高度(h1)，按公式(4)、(5)計算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.3.7 菜籽肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照Pearce等[12]方法測定。將菜籽蛋白、肽溶解于50mL、0.1mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)，配制成不同質(zhì)量濃度的菜籽蛋白、肽溶液，取出15mL按照油、蛋白質(zhì)或肽體積比1:3的比例向蛋白質(zhì)、肽溶液中加入大豆色拉油，最終體積為20mL。室溫10000r/min乳化均質(zhì)1min，分別在0、10min從底部取樣。以0.1g/100mL SDS稀釋100倍，測定波長500nm處的吸光度，以SDS溶液為空白，0時刻的吸光度表示乳化性，乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)表示。

式中：A0為0時刻的吸光度；Δt為時間差，10min；ΔA為Δt內(nèi)的吸光度差值。

1.3.8 菜籽肽凝膠性的測定

用質(zhì)構(gòu)儀(TPA)測定凝膠的強(qiáng)度，選用直徑為10mm的圓柱狀平頭沖頭(探頭型號P/0.5)。測前速度：2mm/s；測試速度：1mm/s；測后速度：2mm/s；穿刺距離：10mm；時間：5s。做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值得到凝膠質(zhì)構(gòu)參數(shù)。

1.3.9 清除DPPH自由基能力的檢測

采用DPPH氧化法測定[13]。在潔凈試管中加入不同發(fā)酵時間的樣品溶液，再加入2mL的DPPH 無水甲醇溶液(0.1mmol)，混勻，室溫下避光靜置30min后，測波長517nm處的吸光度，按公式(7)計算菜籽肽清除DPPH自由基的能力。

式中：A0為DPPH自由基無水乙醇溶液(空白對照)的吸光度；Ai為DPPH自由基無水乙醇溶液+樣品的吸光度；Aj為無水乙醇+樣品的吸光度。

1.3.10 菜籽肽分子質(zhì)量測定

參照文獻(xiàn)[6]采用凝膠過濾色譜法測定。色譜條件：Superose 1210/300GL(10mm×300mm)柱；流動相50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.0，0.15mol/L NaCl；流速0.5mL/min；進(jìn)樣體積500μL；檢測波長215nm。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白(分子質(zhì)量MW67000D)、細(xì)胞色素(MW12700D)、鈷胺酰胺(VB12，MW1355D)、Gly-Gly-Tyr-Arg(MW451.48D)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組指標(biāo)測定重復(fù)3次，取平均值。采用方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽肽的溶解性

圖1 不同pH值時菜籽蛋白和發(fā)酵菜籽肽的溶解性Fig.1 Effect of pH on solubility of RSP and RP

蛋白質(zhì)、肽的溶解性直接影響到它在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解性對其他功能性質(zhì)如吸水性、起泡性、乳化性和凝膠等有直接的影響，不溶性蛋白質(zhì)在食品中的應(yīng)用是非常有限的。圖1顯示了不同pH值條件下菜籽蛋白和菜籽肽的溶解性，在pH3.0～5.0范圍內(nèi)，菜籽蛋白溶解性較低，而pH值高于8.0以后隨pH值的升高，溶解性逐漸增大，pH12.0時菜籽蛋白NSI值可以達(dá)到90%以上；在pH3.0～4.0和pH7.0菜籽蛋白溶解性出現(xiàn)最低點(diǎn)，可能是該pH值是菜籽蛋白的等電點(diǎn)[14]，而偏離等電點(diǎn)(pH12.0，pH2.0)時蛋白質(zhì)有較高的溶解性。另外，與菜籽蛋白相比，發(fā)酵菜籽肽在較寬的pH值(2.0～12.0)范圍內(nèi)都保持較高的溶解性，這主要是發(fā)酵時產(chǎn)生的蛋白酶水解大分子蛋白為小分子蛋白肽的原因，發(fā)酵提高了菜籽蛋白的溶解性。

圖2 菜籽肽的分子質(zhì)量分布Fig.2 Molecular weight distribution profile of RSP

利用凝膠過濾色譜對菜籽肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行研究，由圖2可以看出，菜籽粕固態(tài)發(fā)酵后，大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)被水解成小分子質(zhì)量菜籽多肽，且主要是分子質(zhì)量為300～3000的短肽，正是由于菜籽肽中含有較多的小分子質(zhì)量物質(zhì)，才提高了菜籽肽的溶解性。

2.2 菜籽蛋白和發(fā)酵菜籽肽的吸水力、吸油力

蛋白質(zhì)、肽的吸水力與吸油力受pH值、溫度、離子強(qiáng)度的影響。具有較高吸水力與吸油力的蛋白質(zhì)、肽可以作為強(qiáng)化劑添加到食品中，改善其感官品質(zhì)。由于菜籽肽在較寬的pH值下都具有較高的溶解性，因此功能性質(zhì)的研究不考慮pH值對其的影響。由圖3可以看出，隨著溫度的升高(20～80℃)，菜籽蛋白的吸水力與吸油力變化不大，而發(fā)酵菜籽肽的吸水力和吸油力則隨著溫度的升高而降低。在較高溫度時，菜籽肽吸油力較低，而在較低溫度時，菜籽肽的吸油力較強(qiáng)，這主要是因?yàn)樵谳^低溫度時油的黏性較大所致。另外，總體上看，不同溫度下，菜籽蛋白的吸水力和吸油力都高于發(fā)酵菜籽肽，原因可能是發(fā)酵菜籽肽分子質(zhì)量較小，界面面積較小，對油和水的吸附能力較弱。此結(jié)果與Cumby等[15]的研究結(jié)果一致。

圖3 不同溫度下菜籽蛋白和發(fā)酵菜籽肽的吸水力和吸油力Fig.3 Effect of temperature on water and oil-binding capacities of RSP and RP

2.3 菜籽肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性

圖4 菜籽蛋白、發(fā)酵菜籽肽的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.4 Comparisons on foaming capacity and foam stability of RSP and RP

蛋白質(zhì)、肽的起泡能力主要取決于其溶解性，蛋白質(zhì)高溶解性是良好的起泡能力和穩(wěn)定性的先決條件[16]。由圖4可以看出，發(fā)酵菜籽肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于菜籽分離蛋白，這是因?yàn)樵趐H7.0時發(fā)酵菜籽肽比菜籽蛋白有較好的溶解性，同時，起泡性受表面張力的影響，蛋白質(zhì)水解后，水解物黏度降低，低表面張力對泡沫的形成比較有利。

2.4 菜籽肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖5 菜籽蛋白、發(fā)酵菜籽肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性Fig.5 Comparisons on emulsifying capacity and emulsion stability of RSP and RP

蛋白質(zhì)、肽的溶解度與其乳化容量或乳狀液穩(wěn)定性之間通常存在正相關(guān)，不溶性蛋白質(zhì)對乳化作用的貢獻(xiàn)很小，但不溶性蛋白質(zhì)顆粒常常能夠在已經(jīng)形成的乳狀液中起到加強(qiáng)穩(wěn)定作用[17]。另一方面，蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度對其乳化性和乳化穩(wěn)定性有著直接的影響，乳化性和乳化穩(wěn)定性隨蛋白液質(zhì)量濃度的增加而增大。由圖5可以看出，發(fā)酵菜籽肽和菜籽蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性都隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，在高質(zhì)量濃度下(≥2g/100mL)發(fā)酵菜籽肽的乳化性要高于菜籽蛋白的乳化性，而發(fā)酵菜籽肽的乳化穩(wěn)定性在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(1～5g/100mL)要低于菜籽蛋白的乳化穩(wěn)定性，原因可能是蛋白質(zhì)水解后，疏水性殘基暴露在蛋白質(zhì)表面，降低了油水界面的張力，而提高了其乳化能力[18]。

2.5 菜籽肽的凝膠性

表1 菜籽蛋白、發(fā)酵菜籽肽的凝膠性Table 1 Comparisons on gel properties of RSP and RP

凝膠化作用和形成凝膠結(jié)構(gòu)是食品蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)，通過對蛋白質(zhì)的限制性改性可以提高其凝膠性，而小分子多肽一般不具有凝膠性。由表1可以看出，與發(fā)酵菜籽肽相比，菜籽蛋白具有較好凝膠性。菜籽蛋白的硬度較高，但是其脆度和內(nèi)聚性都低于菜籽肽，原因是菜籽蛋白水解成小分子肽后，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用減弱，加熱時分子之間交聯(lián)程度降低，無法形成凝膠[19]。

2.6 菜籽肽清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種被廣泛使用的自由基，在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，在517nm處有一個特征吸收峰，當(dāng)其遇到自由基清除劑時，DPPH的孤電子被配對，其乙醇溶液的顏色從深紫色轉(zhuǎn)變成黃色，吸光度變小。因此，可通過測定吸光度的變化來評價對DPPH自由基的捕獲效果。該方法靈敏、簡便、實(shí)用且重現(xiàn)性好，一般常用于天然有機(jī)化合物和植物提取物的抗氧化活性考察[20]。

圖6 菜籽肽清除DPPH自由基的能力Fig.6 Comparison on DPPH free radical scavenging capacity of VC,VE and RSP

由圖6可知，菜籽肽具有較好的清除DPPH自由基的能力。在較低的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0～1000μg/mL)，隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為900μg/mL時達(dá)到最大值80%(該值比大豆發(fā)酵產(chǎn)物高出很多，50mg/mL，60%)[21]，之后再增加質(zhì)量濃度，對DPPH自由基的清除能力變化不大；在低質(zhì)量濃度范圍(0～500μg/mL)，菜籽肽對DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度成線性相關(guān)(R2=0.9912)，IC50為328μg/mL。但是總體看來菜籽肽對DPPH自由基的清除能力要低于VC和VE。

3 結(jié) 論

發(fā)酵菜籽肽具有良好溶解性，在pH2.0～12.0范圍內(nèi)保持較高的氮溶解指數(shù)(NSI＞85%)，而菜籽蛋白在pH8.0以下會凝聚沉淀，溶解性較低。因此，與菜籽蛋白相比，菜籽肽更適合于酸性飲料的開發(fā)。

與菜籽蛋白相比，發(fā)酵菜籽肽具有良好的乳化性能，在較寬的pH值范圍和較大的質(zhì)量濃度范圍(2～5g/100mL)內(nèi)均表現(xiàn)出良好的乳化性和乳化穩(wěn)定性；發(fā)酵菜籽肽也具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，但是凝膠性較差；吸水力及吸油力不及菜籽蛋白；另外，在0～500μg/mL質(zhì)量濃度范圍，菜籽肽具有較高的DPPH自由基清除能力。發(fā)酵菜籽肽經(jīng)進(jìn)一步純化后可作為添加劑添加到攪打食品中，如糖果、糕點(diǎn)、蛋黃醬等中，改善其感官品質(zhì)的同時，也提高了其營養(yǎng)功能。

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Functional Properties of Rapeseed Peptides Derived from Solid-state Fermentation

JU Xing-rong1，HE Hai-yan1，HE Rong2，WANG Li-feng1,2，YUAN Jian1
(1. Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology，Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

TS221

A

1002-6630(2010)21-0045-05

2010-05-26

國家“863”計劃項(xiàng)目(2007AA10Z331)；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045)

鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)及功能性成分開發(fā)。E-mail：xingrongju@163.com