一株產抗菌活性物質解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定

楊勝遠，韋 錦，李 云，姚 虹，黃月丹

(1.韓山師范學院生物系，廣東 潮州 521041；2.韓山師范學院圖書館，廣東 潮州 521041)

一株產抗菌活性物質解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定

楊勝遠1，韋 錦2，李 云1，姚 虹1，黃月丹1

(1.韓山師范學院生物系，廣東 潮州 521041；2.韓山師范學院圖書館，廣東 潮州 521041)

從菜園土壤中分離篩選到1株產廣譜抗菌活性物質的菌株K6，其抗菌活性物質對藤黃微球菌、大腸桿菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、釀酒酵母、匍枝根霉和白色念珠菌均有抑制作用，其中對革蘭氏陽性菌的抑菌作用最強，對霉菌的抑制作用相對較弱。通過形態特征、16S rDNA序列分析和系統發育分析，菌株K6與B. amyloliquefaciens位于同一簇群，同源性達99%，將其初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

抗菌活性物質；16S rDNA；系統發育分析；解淀粉芽孢桿菌

Abstract：A strain producing broad-spectrum antimicrobial substances, named K6, was isolated and screened from the soil of a local vegetable garden in Xiangqiao district, Chaozhou city, which presented an inhibition effect on the growth ofMirococcus luteus,Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa,Bacillus subtilis,Bacillus cereus,Bacillus megaterium,Bacillus thuringiensis,Saccharomyces cerevisiae,Rhizopus stoloniferandCandida albicans. The strongest inhibition effect on gram-positive bacteria was observed. Base on the morphological, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K6 was classified asBacillus amyloliquefaciens.

Key words：antimicrobial substance；16S rDNA；phylogenic analysis；Bacillus amyloliquefaciens

食品含有大量的水分和豐富的營養成分，是微生物天然的良好培養基，只要條件適宜，微生物就會大量繁殖，導致食品腐敗變質。通過防腐劑抑制或殺滅微生物，可以起到阻止、延緩食品的變質。目前食品防腐劑主要為合成防腐劑，如苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對羥基苯甲酸酯類等。但經長期的研究，發現一些合成防腐劑有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題。隨著人民生活水平的不斷提高，對健康的日益關注以及對食品的衛生安全性的日趨重視，對食品防腐劑的要求也越來越高，因此研究開發高效、廣譜、安全的新型防腐劑具有重要意義[1]。

食品防腐劑的天然化和營養化已成為防腐技術的發展趨勢，植物源、動物源和微生物源天然防腐劑的研究開發已成為食品領域的研究熱點[2]，特別是微生物源天然防腐劑的研究備受人們的關注。乳酸鏈球菌素(nisin)[3]、納他霉素(Natamycin)[4]、表面活性素(surfactin)[5]、芬薺素(fengycin)[6]、伊枯草菌素(iturin)[7]、桿菌霉素(bacillomycin)[8]、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)[9]、制磷脂菌素(plipstatin)[10]等微生物源抗菌活性物質的結構、抑菌機理和安全性均得到了深入研究，其中乳酸鏈球菌素和納他霉素已獲準應用于在食品或飼料行業。然而，目前微生物源防腐劑仍然存在產量低、價格昂貴等缺點，極大地限制了其廣泛應用，因此高產廣譜抗菌活性物質的菌種選育仍亟待研究人員不懈努力。

本課題組從菜園的土壤中分離篩選到了1株具有廣譜抗菌活性的菌株K6，本實驗主要對其篩選、鑒定及抗菌譜進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品取自潮州市湘橋區打索上埠村菜園。

1.2 活性檢測靶菌

藤黃微球菌(Mirococcus luteus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、白色念珠菌(Candida albicans)為韓山師范學院食品與發酵研究所保藏菌種。

1.3 試劑與儀器

TaqDNA聚合酶 立陶宛MBI Fermentas公司；dNTPs 天為時代公司；酵母膏和蛋白胨 Oxoid公司；其他試劑均為國產分析純。

PTC-100TMPCR儀 MJ Research公司；EPS604水平電泳儀 南京科寶儀器公司。

1.4 培養基

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基[11]；霉菌采用PDA培養基[11]；酵母采用YPD培養基[12]。

1.5 PCR引物

參照文獻[11]設計通用引物，其中正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，由上海生工生物工程服務有限公司合成。

1.6 方法

1.6.1 抗菌活性物質產生菌的分離篩選

取土壤25g，放入裝有225mL無菌水的錐形瓶中(含適量的玻璃珠)，振蕩錐形瓶20min，靜置20～30s，制成10-1稀釋液，再按10倍梯度稀釋法分別將菌懸液稀釋成 10-2、10-3、10-4、10-5和 10-6，然后分別取 10-4、10-5和10-6菌懸液0.1mL于牛肉膏蛋白胨平板進行涂布，于37℃恒溫培養24h。分別將單菌落進行編號，先采用無菌牙簽轉接于另一塊平板進行備份，然后將單菌落以自制無菌打孔器切成直徑為5mm的瓊脂塊，置于含藤黃微球菌為指示菌的平板上，于37℃恒溫培養48h，觀察抑菌情況。從備份平板上將具有產抑菌活性物質的菌株轉接于牛肉膏蛋白胨平板斜面，于37℃恒溫培養24h后于4℃冰箱中保藏備用。

1.6.2 抗菌活性物質的初步分離純化

將具有抗菌活性的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于37℃搖床培養24h，于10000×g離心15min，取300mL上清液冷凍干燥，然后加入30mL無水甲醇進行溶解，于10000×g離心15min。沉淀物用30mL無菌水進行溶解，備用；上清液于50℃旋轉蒸發去除甲醇，再加入30mL無菌水進行溶解，備用。以牛肉膏蛋白胨液體培養基采用相同操作作為對照。分別取上述組分200μL，采用管碟法[13]測定其對藤黃微球菌(37℃，培養24h)的抑菌活性。

1.6.3 抗菌活性物質的抗菌譜測定

按1.6.2節方法采用無水甲醇對抗菌活性物質進行提取純化，再分別取200μL純化液采用管碟法[13]測定其對活性檢測靶菌的抑菌活性。用游標卡尺測抑菌圈的直徑(diameter of antibiotic circle，DAC)，以抑菌圈的直徑表示抗菌活性。

供試靶細菌和酵母的菌體密度以及霉菌孢子密度均為108/mL，細菌于37℃培養24h，酵母30℃培養48h，霉菌28℃培養60h。

1.6.4 菌株K6的分類鑒定

1.6.4.1 形態特征

參照文獻[14]進行。將菌株K6接種到牛肉膏蛋白胨平板，于37℃培養24h，觀察菌落形態及細胞形態。細胞形態采用革蘭氏染色和簡單染色進行觀察。

1.6.4.2 細菌總DNA的制備

吸取10mL培養好的細菌培養液，5000×g離心10min，沉淀用TE洗滌后，再次離心，菌體重懸于4mL TE溶液；加入50mg/mL溶菌酶溶液8μL，37℃保溫20min；加入RNase (10mg/mL) 10μL，至終質量濃度為25μg/mL，然后加入10g/100mL SDS溶液0.5mL，37℃保溫30min；加入蛋白酶K(20mg/mL) 10μL，至終質量濃度為50μg/mL，37℃保溫60～90min；加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇(25:24:1，V/V)，混勻，于8000×g離心5min，取上清液轉入另一離心管中，如此2～3次；將上清液中加入0.1倍體積的醋酸鈉和兩倍體積的冷的無水乙醇，旋轉離心管，出現沉淀物DNA；70%乙醇洗滌一次，室溫下干燥；加入0.5mL TE或雙蒸水溶解DNA作為PCR模板。

1.6.4.3 PCR擴增

采用細菌16S rDNA的通用引物27F和1541R進行擴增。擴增體系為10mmol/mL MgCl23μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP(2.5μmol/L)4μL，TaqTM(5U/μL)0.25μL，上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，最后加雙蒸水至50μL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上95℃變性5min，然后94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸10min。

1.6.4.4 16S rDNA的測序

16S rDNA的純化和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.6.4.5 序列比對

將所測定的16S rDNA序列通過NCBI-NLM中Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)程序與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數據庫中核苷酸序列在線進行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)[15]。

1.6.4.6 系統發育分析

根據形態特征觀察結果，通過GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數據庫選取芽孢桿菌屬的各個種的16S rDNA核苷酸序列，采用BioEdit_7.0.0軟件進行Clustal W多重比對，利用Clustal X1.8軟件采用Neighbourjoining方法構建系統發育樹，并進行Bootstrap分析，重復次數為1000次。

2 結果與分析

2.1 抗菌活性物質產生菌的分離篩選

從菜園土樣中分離篩選到1株菌株K6，其菌落瓊脂塊對藤黃微球菌具有抑菌作用(圖1)，說明菌株K6具有產抗菌代謝物活性。

圖1 菌株K6瓊脂塊對藤黃微球菌的抑菌活性Fig.1 Anti-M. luteusactivity of agar piece with cultured strain K6

2.2 抗菌活性物質的初步分離純化

圖2 解淀粉芽孢桿菌K6發酵液甲醇純化組分對藤黃微球菌的抑菌活性Fig.2 Anti-M. luteusactivity of methanol soluble fraction of fermentation broth of strain K6

如圖2所示，解淀粉芽孢桿菌K6的發酵液經無水甲醇處理后，溶于無水甲醇的組分對藤黃微球菌具有較強的抑制作用，而不溶于無水甲醇的沉淀組分對藤黃微球菌沒有抑菌作用，說明菌株K6的抗菌活性物質溶于甲醇。因此，可以采用無水甲醇對發酵液干燥物中的抗菌活性物質進行提取和初步純化。

2.3 菌株K6抗菌活性物質的抗菌譜測定

表1 菌株K6抗菌活性物質的抗菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of strain K6

表1顯示，菌株K6的抗菌活性物質對M. luteus、E. coli、S. cerevisiae、P. aeruginosa、B. subtilis、B. cereus、B. megaterium、B. thuringiensis、R. stolonifer、C. albicans均有抑制作用。結果表明：菌株K6的抗菌活性物質對供試的革蘭氏陽性和陰性細菌、酵母以及霉菌等靶菌都具有抗菌作用，抗菌譜較廣。

2.4 菌株K6的分類鑒定

2.4.1 形態特征

菌株K6在牛肉膏蛋白胨培養基上呈淡黃色菌落，表面干燥且粗糙，邊緣不整齊。革蘭氏染色呈陽性，短桿狀，兩端鈍圓，單個、成對或成串出現，有芽孢，芽孢囊不膨大，芽孢橢圓形，中生到次端生。根據形態特征初步判斷菌株K 6屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.4.2 菌株K6的16S rDNA序列分析

菌株K6的PCR擴增產物的電泳分析表明其大小在1.5kb左右。經測序，菌株K6的16S rDNA核苷酸序列大小為1347bp，其序列已在GenBank中登記，登記號為GU591157。經與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數據庫中報道的16S rDNA核苷酸序列比對，結果顯示菌株K6的16S rDNA核苷酸序列與Bacillus amyloliquefaciens(登記號分別為FJ960508、FJ705346、FJ889057、GU125644、GQ903336、DQ422953 等)、Bacillus licheniformis(登記號 FJ713021)、Bacillus subtilis(登記號分別為EF377562、FJ437209、EF488103、EU771079、EU624322、EU564337、EU489517 等)和Bacillus velezensis(登記號分別為FJ426275、AB244441、AB244428等)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(max ident)達到99%，最大分值(max score)為2447bits。

圖3 基于16S rDNA序列同源分析的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

根據菌株K6的形態特征和16S rDNA核苷酸序列的比對結果，選取芽孢桿菌屬各個種的16S rDNA核苷酸序列與菌株K6的16S rDNA核苷酸序列構建系統發育樹(圖3)，結果顯示菌株K6與B. amyloliquefaciens(DQ422953)位于同一簇群，親緣關系最近，在1000次Bootstrap分析中有468次支持該分枝。

根據菌株K6的形態特征和16S rDNA核苷酸序列的分析以及系統發育分析，將菌株K6初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。

3 討 論

在早期分類系統中，解淀粉芽孢桿菌歸為枯草芽孢桿菌的一個亞種[16]，后來的分類系統才將兩者劃分開來[17]。B. amyloliquefaciens許多表型特征與B. subtilis非常相似，僅通過形態、培養特征及其生理生化特性很難區分，只有通過進一步的基因序列比較才可以將兩者區分[18]。本實驗通過16S rDNA序列比對分析表明，菌株K6與B. amyloliquefaciens，B. subtilis，B. lichenoformis，B. velezensis的相似性均達到了99%，圖3也顯示B. amyloliquefaciens，B. subtilis，B. lichenoformis和B. velezensis位于同一分支，親緣關系非常接近，僅從序列比對結果很難將對它們進行鑒別，只有進一步采用系統發育分析，才能將菌株K6歸屬于B. amyloliquefaciens。因此，對微生物鑒定必須結合多種分類技術和方法才能做出正確的分類結論。

生理生化特征是微生物分類的重要依據之一，理論上可以通過生理生化實驗結果對16S rDNA序列分析結果進行驗證。然而，利用生理生化特征對微生物進行鑒定也是依據最大相似性的原則進行分類，由于種間生理生化特征差異較小，并且一些生理生化特征因長期受到生長環境的影響會發生改變[19]，因此生理生化特征對種間的鑒定中區分度不大，并不適宜作為驗證16S rDNA序列分析結果正確與否的手段。

解淀粉芽孢桿菌可產α-淀粉酶、β-1,3-1,4-葡聚糖酶、蛋白酶等多種酶類，已廣泛用于酶制劑生產[20-22]。一些研究表明，解淀粉芽孢桿菌還能產生抗菌蛋白、iturin(伊枯草菌素)、surfactin(表面活性素)、fengycin(芬薺素)和bacillomycin(桿菌霉素)等抗菌物質，抗菌譜廣，特別是對于霉菌有較好的抑制作用[23-27]。本實驗從菜園的土壤中分離篩選到了1株產廣譜抗菌活性物質的B. amyloliquefaciensK6，其甲醇提取物對細菌和酵母具有較好的抑制作用，對匍枝根霉的抗菌活性相對較弱，是否存在抗菌活性物質的結構或組分差異，還需進一步研究。

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Screening and Identification of aBacillus amyloliquefaciensStrain Producing Antimicrobial Substances

YANG Sheng-yuan1，WEI Jin2，LI Yun1，YAO Hong1，HUANG Yue-dan1
(1. Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China；2. Library of Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

Q939

A

1002-6630(2010)21-0208-05

2010-02-23

廣東省自然科學基金項目(8452104101001546)；國家級星火計劃項目(2008GA780032)；韓山師范學院科研基金項目

楊勝遠(1972—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物及生物技術。E-mail：yshengyuan2004@yahoo.com.cn