泥鰍肉酶解物對羥自由基的清除作用

姚東瑞，王淑軍，李圓圓，盤賽昆，楊 帆,2

(1.淮海工學院食品工程學院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學食品工程學院，遼寧 大連 116000)

泥鰍肉酶解物對羥自由基的清除作用

姚東瑞1，王淑軍1，李圓圓1，盤賽昆1，楊 帆1,2

(1.淮海工學院食品工程學院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學食品工程學院，遼寧 大連 116000)

為了探討深度開發泥鰍蛋白制備功能性肽的可能性，采用比色法研究泥鰍肉酶解物對Fenton體系產生的羥自由基的清除效果，從復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶5種酶中，篩選出菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有清除羥自由基活性酶解物的適宜水解酶。用響應面分析法(RSM)對該酶的酶解條件進行優化，并采用Sephadex G-15凝膠層析測定最佳酶解條件下制得的酶解液中活性肽的相對分子質量分布。結果表明，菠蘿蛋白酶的最佳酶解條件為：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、溫度54.48℃、酶解時間59.97min，酶解物對羥自由基的清除率為99.03 %，IC50值為0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相對分子質量范圍為1129～2344。

泥鰍肉；酶解物；羥自由基

Abstract：In order to obtain bioactive peptides having better ability to scavenge hydroxyl free radicals generated in Fenton system,the muscle of loach (Misgurnus anguillicaudatus) was hydrolyzed separately with flavourzyme, protamex, trypsin and pepsin and bromelain, and bromelain was the selected protease for the hydrolysis of loach muscle. The subsequent investigations involved optimization of the hydrolysis of loach muscle by response surface methodology for achieving maximum hydroxyl free radical scavenging rate and Sephadex G-15 gel column chromatographic determination of relative molecular mass distribution of the hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions. The optimal conditions for bromelain-catalyzed hydrolysis of loach muscle were determined as follows:solid/liquid ratio, 1:4; enzyme dose, 0.2%; pH, 6.47; hydrolysis temperature, 54.48 ℃; and hydrolysis duration, 59.97 ℃. The hydrolysate obtained under these conditions displayed a free radical scavenging rate of 99.03%and an IC50 value of 0.57 mg/mL, and contained peptides having a relative molecular mass varying from 1129 to 2344.

Key words：loach (Misgurnus anguillicaudatus)；enzymatic hydrolysis；hydroxyl free radical

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)是滋補佳品，素有“水中人參”的美譽。其肉質細嫩，營養價值較高，含有多種對人體有益的生物活性物質如蛋白質、多不飽和脂肪酸、賴氨酸等必需氨基酸、類胡蘿卜素、尼克酸等維生素以及鋅、硒等微量元素[1]。它們具有提高機體免疫活性的作用，對于人類防病治病、強身健體、延年益壽大有裨益，因此研究泥鰍肉中的活性成分具有實際應用價值。近10多年來，國內外對泥鰍中生物活性成分如凝集素[2]、泥鰍素(misgurin)[3]、超氧化物歧化酶[4]、泥鰍多糖[5]、牛磺酸[5]和透明質酸[6]的研究報道較多，但對泥鰍肉酶解物對羥自由基(·OH)清除作用的研究尚未見報道。

20世紀50年代中期Harman首先提出衰老自由基學說，該學說認為自由基攻擊生命大分子造成組織損傷，是引起機體衰老的根本原因，也是誘發腫瘤的惡性疾病的重大原因[7]，其中·OH是一種氧化能力很強的自由基，是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基[8]。

生物活性肽易被人體消化吸收，同時具有抗氧化、抗疲勞、調節激素和降血壓等功能。抗氧化多肽是生物活性肽的一種，它具有通過減少氧自由基和羥自由基從而達到抗衰老的功能，因此含有生物活性肽的各種保健食品的開發具有廣闊的市場前景。本實驗采用Fenton體系測定泥鰍肉酶解物對·OH的清除作用，旨在為利用泥鰍肉蛋白制備抗氧化活性肽提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍購于連云港敦尚鎮泥鰍養殖基地，經淮海工學院水產養殖系程漢良教授鑒定為泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，去頭、尾和血并洗凈，置于－40℃冰箱中冷凍備用。

復合蛋白酶(42300U/g)、復合風味蛋白酶(31800 U/g)諾維信(沈陽)公司；菠蘿蛋白酶(43600U/g)、胰蛋白酶(41000U/g)、胃蛋白酶(28000U/g) 廣州市齊云生物技術有限公司；α-脫氧核糖(2-Deoxy-D-ribose)、硫代巴比妥酸(TBA) 生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

BS323S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DKZ-3型電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科技有限公司；日立CR22G高速冷凍離心機 日本Hitach公司；SynergyTM HT型多功能酶標儀 美國Bio-Tek公司；BioLogic DuoFlowTM層析系統 美國Bio-Rad公司；PHS-3C型pH計 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

鮮活泥鰍→預處理→冷凍備用→解凍→加水攪打均勻→酶解→滅酶(沸水浴，10min)→冷卻→10000r/min離心20min→收集上清液

1.3.2 酶活力測定

采用Folin-酚法，以酪蛋白為底物，參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[9]進行測定。

1.3.3 水解度測定

式中：CN為水解液中游離氨基氮的含量/(g/100mL)；CN0為魚糜液水解前游離氨基氮的含量/(g/100mL)；C為魚糜液中蛋白氮的含量/(g/100mL)。

游離氨基氮采用甲醛電位滴定法測定[10]，蛋白氮采用微量凱氏定氮法測定[11]。

1.3.4 對羥自由基清除作用實驗

[12-13]測定泥鰍肉酶解物對Fenton體系產生的羥自由基清除率。IC50定義為清除50%羥自由基時的多肽質量濃度(mg/mL)，用SPSS13.0 統計軟件的概率單位法(probit)計算。多肽含量測定采用Lowry法[14]。

1.3.5 酶的篩選

取泥鰍肉10g，加水30mL，以0.29%加酶量(m酶/m泥)分別加入菠蘿蛋白酶(pH 7.0，50℃)、復合蛋白酶(pH7.0，50℃)、胰蛋白酶(pH8.0，55℃)、復合風味蛋白酶(pH7.0，50℃)和胃蛋白酶(pH2.0，37℃)，再分別在上述酶的適宜pH值和溫度下進行酶解實驗，以IC50及水解度為指標考察0～240min內(間隔30min)供試酶酶解液對羥自由基的清除效果及水解進程。

1.3.6 泥鰍肉酶解物的相對分子質量分布測定

酶解物相對分子質量分布的測定采用凝膠層析法[15]。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

圖1 5種供試酶對泥鰍肉的水解進程Fig.1 Hydrolysis courses of loach muscle with five proteases

圖2 不同蛋白酶酶解物對清除羥自由基的影響Fig.2 Change in IC50of loach muscle hydrolysate during hydrolysis with five proteases

如圖1所示，隨著時間延長，不同蛋白酶作用下的水解度逐漸增加，但增加趨勢變緩和。圖2顯示，未經酶解的泥鰍肉勻漿具有一定清除羥自由基的能力，其清除率達45.7%，IC50為2.32mg/mL。除了胰蛋白酶外，供試的4種酶酶解物對羥自由基的清除能力均較未經酶解的勻漿有顯著提高，但不同蛋白酶酶解物的清除作用存在一定差異，沒有一定的規律性，并且水解度和清除率之間沒有相關性，因此酶的選擇及工藝條件的優化在制備功能肽時是非常必要的。菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶酶解物對羥自由基清除活性較高，但菠蘿蛋白酶能在較短的時間內即可達到較好的效果，而胃蛋白酶達到相當的效果則需要較長的水解時間，因此選用菠蘿蛋白酶用于下一階段的研究。

2.2 單因素試驗

2.2.1 固液比對酶解物清除羥自由基的影響

選取固液比1:3、1:4、1:5、1:6，調節pH7.0，加酶量為0.29%，在50℃下酶解60min，測定酶解液水解度及其對羥自由基的清除率，結果如圖3所示。

圖3 固液比對清除羥自由基的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

從圖3可知，在固液比為1:4時，水解度及酶解物對羥自由基的清除率同時達到最高，隨著固液比的增大，底物濃度變小，水解度及清除率均呈下降趨勢，因此，固液比為1:4是比較適宜的。

2.2.2 加酶量對酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，加酶量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及其對羥自由基的清除率，結果如圖4所示。

圖4 加酶量對清除羥自由基的影響Fig.4 Effect of enzyme dose on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

從圖4可以看出，底物濃度保持不變，加酶量為0.2%時，酶解物對羥自由基的清除率最高，之后隨著酶使用量的增加，清除率呈現下降趨勢，并逐漸保持平穩，DH最大時清除率并非最大。

2.2.3 pH值對酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，調節pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及其對羥自由基的清除率，結果如圖5所示。

圖5 pH值對清除羥自由基的影響Fig.5 Effect of pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖5可見，在pH6.5時，酶解物對羥自由基的清除能力最強，當pH值超過6.5時，酶解物對羥自由基的清除能力明顯下降，而水解度在pH7.0時達到最大，這說明在相同的作用時間下，酶活力最強時水解得到的肽不一定具有活性肽的結構。

2.2.4 溫度對酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，分別選取酶解溫度45、50、55、60、65℃，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及其對羥自由基的清除率，結果如圖6所示。

圖6 酶解溫度對清除羥自由基的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖6可見，酶解物對羥自由基的清除率隨溫度升高逐漸增大，在溫度為50℃時達到最高值，因此選擇最適酶解溫度為50℃，繼續提高溫度，清除率下降較快。這是因為高于酶作用的溫度范圍后，酶的性質受到影響，從而影響酶解物對羥自由基的清除作用。

2.2.5 酶解時間對清除羥自由基的影響

固液比1:4，分別選取酶解時間30、45、60、75、90min，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及其對羥自由基的清除率，結果如圖7所示。

由圖7可知，酶解時間為60min時，酶解物顯示出最強的羥自由基清除作用。隨著時間延長，雖然水解度有所提高，但酶解物清除自由基的能力卻明顯下降。單因素試驗結果顯示，水解度與酶解物清除自由基的能力之間并沒有顯著的一致性規律。這可能是因為酶解物對羥自由的基清除作用主要取決于肽鏈中暴露的氨基酸側鏈基團的性質和肽的氨基酸序列，而與水解程度無直接相關性[16]。

圖7 酶解時間對清除羥自由基的影響Fig.7 Effect of hydrolysis duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3 優化分析試驗

2.3.1 響應面分析方案及結果

據單因素試驗結果，通過SPSS V13.0軟件分析作單因素方差分析，結果表明溫度、時間、pH值三個因素對清除率有顯著影響。利用Design-Expert 6.0.10.Trial軟件，根據中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平共20個試驗的響應面分析試驗，泥鰍肉酶解物清除羥自由基試驗設計方案與試驗結果見表1。

表1 響應面試驗設計與結果Table 1 Response surface design arrangement and experimental results

對表1試驗數據進行多元線性回歸擬合，對模型進行方差分析及顯著性檢驗，采用手動優化的方法對設計進行優化，去掉對結果影響不顯著的項，結果見表2。

從表2可以看出，模型及失擬項的P值分別為0.0001和0.1110，表明該模型擬合良好。其中溫度和pH值對響應值有顯著的交互作用，溫度和時間的交互作用次之。

表2 響應面試驗結果分析表Table 2 Analysis of variance for fitted regression model

2.3.2 羥自由基清除率的響應面分析

圖8 時間、溫度交互作用對清除率影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.8 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖8可見，當pH值和酶解時間不變時，隨著酶解溫度的升高，自由基清除率升高，增幅比較顯著，增加到一定程度后，變化不太明顯；當pH值和酶解溫度不變時，自由基清除率隨著酶解時間的增加而升高，當時間增加到一定程度時，自由基清除率基本上趨于平穩。

由圖9可見，當pH值和酶解時間不變時，隨著酶解溫度的升高，自由基清除率升高，增幅比較顯著，增加到一定程度后，基本上趨于平穩；當酶解時間和酶解溫度不變時，自由基清除率隨著pH值的升高而升高，且在pH值比較低時增幅比較顯著，隨著pH值進一步提高，清除率逐漸下降。

圖9 pH值、溫度交互作用對清除率影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.9 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3.3 最佳酶解工藝驗證

經軟件優化后得到酶解的最佳條件為：酶解溫度54.48℃、酶解時間59.97min、pH6.47、固液比1:4、加酶量0.2%，清除率預測值為99.52%。在該條件下重復3次實驗，測得的羥自由基清除率均值為(99.03±0.24)%，通過SPSS V13.0軟件做t檢驗，置信區間為97.52%～99.57%，與預測值無顯著差異，說明模型與實際相符，具有實際指導意義。酶解物的水解度為24.6%，IC50為0.57mg/mL，說明優化后的酶解條件可有效提高功能肽的制備效率。

中國陶瓷本身是古老的傳統產物，具有歷史性，我們推行藝術陶瓷的就更應繼承中國文化傳統的喜聞樂見的文化元素，如以中國傳統題材、吉祥題材、中國陶瓷以線造型的優秀傳統及中國傳統的審美觀，強調藝術陶瓷的特色，體現中國文化元素濃郁的東方藝術魅力，成為陶瓷藝術寶庫中一顆璀璨的明珠，對西方文化要有清晰的認識，“洋為中用”，而不是追求西方的審美趣味和表現特點，當前有些藝術工作者在藝術陶瓷設計中一味追求油畫、抽象畫、版畫的表現方法和效果，缺乏中國文化元素。面對外來藝術形式時，學習并吸收對自身有用的養分，不是簡單的嫁接。

2.4 酶解物的相對分子質量分布

2.4.1 標準曲線

測定Sephadex G-15凝膠柱的V0為17.95mL，Vt為39.94mL，由各標準物的保留時間計算出相應的Ve，進而計算出有效分配系數Kav，制作標準曲線，得標準曲線回歸方程為y=－1.2895x+4.3499，R2=0.9978。

2.4.2 酶解物的相對分子質量分布及清除率的測定

圖10 泥鰍肉酶解液Sephadex G-15層析圖Fig.10 Sephadex G-15 gel chromatographic fractionation of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

由圖10、11可見，具有較高羥自由基清除率的酶解物主要為第1洗脫峰和第2洗脫峰。峰1相對分子質量為2344，IC50為0.36mg/mL；第2峰的相對分子質量為1129，IC50為0.21mg/mL，因此泥鰍肉酶解物抗氧化活性肽是相對分子質量范圍在1129～2344的活性肽，經Sephadex G-15層析分離后的組分較酶解物對羥自由基的清除能力有很大提高(IC50下降)。

圖11 各分離組分的相對分子質量和對羥自由基的清除率Fig.11 Comparisons on relative molecular mass and hydroxyl free radical scavenging rate of various separated fractions of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

3 結 論

3.1 通過對酶解進程及羥自由基清除能力研究發現，水解度與清除能力之間沒有相關性，酶法制備功能肽的關鍵可能在于選擇適合的酶及酶解條件的優化。

3.2 菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有清除羥自由基活性肽的水解酶要優于復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。

3.3 響應面分析法優化酶解工藝條件是可行的，優化得到的最佳酶解條件為：加酶量0.2%、溫度54.48℃、時間59.97min、pH 6.47、固液比1:4，酶解物對羥自由基的清除率為99.03%，IC50為0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相對分子質量范圍為1129～2344。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Loach Muscle for Production of Antioxidant Peptides and Measurement of Their Molecular Weights

YAO Dong-rui1，WANG Shu-jun1，LI Yuan-yuan1，PAN Sai-kun1，YANG Fan1,2
(1. School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Food Engineering College, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China)

Q514

A

1002-6630(2010)21-0029-06

2010-06-23

科技部科技人員服務企業行動項目(2009GJC10044)；江蘇省農業科技自主創新基金項目(CX09-627)；連云港市科技基礎設施建設計劃項目(CK0935)

姚東瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向為水產品加工及漁業經濟。E-mail：yaodr@hhit.edu.cn