大花金挖耳細胞懸浮系的建立及黃酮類化合物的產生

李玉平，龔 寧，王永宏，馮俊濤，張 興,*

大花金挖耳細胞懸浮系的建立及黃酮類化合物的產生

李玉平1,2，龔 寧3，王永宏1，馮俊濤1，張 興1,*

(1.西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌712100；3.西北農林科技大學理學院，陜西 楊凌 712100)

研究不同培養基、蔗糖質量濃度、pH值、接種量、NAA、6-BA、VB1及培養時間對大花金挖耳細胞生長和黃酮類化合物合成的影響。結果表明：NT液體培養基在pH5.5、蔗糖質量濃度40g/L、接種量40g/L鮮質量細胞、NAA 1.0mg/L+6-BA 0.2mg/L時有利于細胞的生長和黃酮類化合物合成，向NT培養基中添加1.0～4.0mg/L VB1有抑制細胞褐化的作用，大花金挖耳懸浮細胞的生長及黃酮類化合物合成隨培養時間的延長，表現出先升高后降低的趨勢，在接種15～21d后，細胞生物量可達23.54～24.51g/L，黃酮類化合物得率為1.19%～1.23%。

大花金挖耳；懸浮培養；生物合成；黃酮類化合物

黃酮類化合物具有抗炎、抗病毒、抗癌、降血脂、降膽固醇、保肝、抗衰老、調節內分泌等多種功能[1-2]，作為一種功能成分，國內外對黃酮類化合物的研究開發十分活躍，但在國內保健食品開發生產方面較為有限，為了進一步提高黃酮的質量，降低產品成本，有必要尋求新的黃酮藥源[2-3]。大花金挖耳(Carpesium macrocephalum Franch.et Sav)是菊科(Compositae)天明精屬多年生草本植物[4]，含有黃酮、萜內酯、甾體等多種化合物，有清熱、解毒、抗腫瘤、止血的醫療作用，并具殺蟲、除草和抑菌等農藥活性[5-9]。利用細胞培養生產黃酮等活性物質[10-11]是突破大花金挖耳生長周期長、生長受到地域和環境因素的限制，解決從大花金挖耳花、果實等部位化學提取活性成分的局限性，并解決黃酮等物質人工合成的困難[12]。有關大花金挖耳細胞懸浮培養的研究尚未見報道，本實驗在前期研究的基礎上[13]，利用愈傷組織建立大花金挖耳細胞的

懸浮培養體系，研究大花金挖耳懸浮培養細胞黃酮類化合物積累的基本條件，為進一步研究和利用大花金挖耳懸浮培養體系生產黃酮類化合物積累基本數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集陜西太白山海拔1600m左右櫟林帶處的大花金挖耳(Carpesium macrocephalum Franch.et Sav) (筆者鑒定并經中科院西北植物研究所副研究員吳正海核實)果實。大花金挖耳種子萌發后，以其無菌苗的幼根誘導出愈傷組織[13]。

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所；萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA) 美國Sigma公司；MS、B5和NT培養基中添加的蔗糖、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素(VB1)、鹽酸吡哆醇、煙酸以及各種無機鹽試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BP-190S天平 Sartorius公司；Tomy ES-315 Tomy High-Pressure Steam Sterilizer Kogyo公司；ZRD-5030全自動鼓風干燥箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；HZT2雙層振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；UV1102紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司。

1.3 方法

硫酸鋁、沸石、十六烷基三甲溴化銨(CTMAB)、陽離子型助凝劑陽離子聚丙烯酰胺(CPAM)、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、試亞鐵靈指示劑、硫酸亞鐵銨、硫酸銀等。

1.3.1 培養基配制

配制MS、B5和NT三種基本培養基[14]，各培養基按實驗設計附加激素、蔗糖，高壓滅菌前調節酸堿度，分裝于250mL三角瓶，每瓶盛100mL培養基，高壓121℃滅菌20min，冷卻待用。

1.3.2 懸浮細胞培養體系的建立

取固體培養基B5上繼代20d左右生長旺盛、疏松、易于分散的愈傷組織接種于B5＋3mg/L NAA +0.2mg/L 6-BA(蔗糖40g/L、搖床120r/min、(25±2)℃，光照度1500～2000lx、光照12h/d)液體培養基中進行細胞懸浮培養，培養5～6d后，培養液中出現懸浮單細胞或小細胞團。繼代培養時，加入等量的新鮮培養液，搖勻，稍靜置，待大細胞團沉降后分瓶，不需過濾，即可得到不含大細胞團塊的培養物。通過3～5次繼代培養，即可得到含單細胞或小細胞團的培養物。取上述繼代培養的細胞，接種于按正交表L9(34)配制的B5培養基(表1)中，考察蔗糖質量濃度、激素、pH值、接種量(鮮質量)對大花金挖耳懸浮細胞培養系中細胞生長和黃酮類化合物合成的影響。

表1 B5培養基組分L9(34)正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing culture conditions in B5 medium

1.3.3 懸浮細胞在不同激素組合的B5、MS、NT培養基中懸浮培養的比較實驗

在以上研究的基礎上，取繼代培養在B5+2.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA(pH5.5，蔗糖40g/L)培養基中3代的懸浮細胞接種40g/L(鮮質量)于不同質量濃度NAA(1.0、2.0、3.0mg/L)和6-BA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.8mg/L)組合的B5、MS、NT三種培養基中，實驗的每種處理接種10～15瓶，測定大花金挖耳懸浮細胞培養系中細胞生物量和黃酮類化合物得率。

1.3.4 VB1對大花金挖耳懸浮培養細胞生長和黃酮類化合物合成的影響

取繼代培養7～10d的懸浮細胞接種40g/L于已附加0.5、1.0、2.0、4.0、6.0mg/L等不同質量濃度VB1的NT+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA(pH5.5，蔗糖40g/L)培養基中，考察VB1對大花金挖耳細胞懸浮培養的影響。

取繼代培養7～10d的懸浮細胞接種40g/L鮮質量于NT+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA(pH5.5，蔗糖40g/L)培養基中，在基本培養條件下進行培養，每隔3d隨機取樣1次，觀察24d，測定懸浮細胞生物量和黃酮類化合物得率。

1.3.6 細胞生物量的測定

將實驗中不同處理懸浮培養20d的褐化細胞進行抽濾，所得細胞在60℃條件下烘干至質量恒定。以收獲時的細胞生物量作生長指標，細胞凈生物量=收獲時的細胞生物量－接種時的細胞生物量。

1.3.7 培養物中黃酮類化合物的分析

黃酮類化合物質量濃度采用分光光度法[15]。用蘆丁標準品繪制標準曲線，確定510nm為檢測波長，以質量濃度C(mg/mL)對吸光度(A)進行線性回歸，得標準曲線回歸方程C=0.0768A－0.0004，r=0.9997。將烘干的細胞粉碎，過60目篩，取細胞干粉適量，丙酮振蕩提取3次，每24h提取1次，合并3次提取液，減壓濃縮后用30%乙醇定容至0.50g/mL，吸取樣品溶液，在510nm波長處測定其吸光度，根據回歸方程及測得的吸光度得出樣品中黃酮類化合物質量濃度(C)，通過公式計算出細胞生物量中的黃酮類化合物得率(X)，X/%＝V×

C/N×M×10-1，式中：V為提取濾液體積/mL；C為提取液中測得的黃酮類化合物質量濃度/(mg/mL)；N為供試細胞生物量/g；M為提取液稀釋的倍數。懸浮培養細胞黃酮類化合物(凈)產量/(mg/L)=黃酮類化合物得率/%×懸浮培養的細胞(凈)生物量/(g/L)×1000。

1.4 數據分析

采用DPS 7.05統計軟件進行單因素方差鄧肯式分析(P=0.05)，以上實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 大花金挖耳細胞懸浮培養體系的建立

在前期研究的基礎上[13]，以B5為基本培養基，研究了蔗糖質量濃度、激素、pH值和接種量4個因素對大花金挖耳懸浮培養細胞的影響(表2)。結果發現在不同組合的培養基中懸浮培養細胞所得黃酮類化合物凈產量差異明顯，最高值和最低值之間相差4.3倍。從表2對實驗結果的直觀分析可知：B因素(NAA+6-BA)對培養細胞所得的黃酮類化合物凈產量影響最大，A因素(蔗糖質量濃度)次之，D因素(接種量)影響為第三，C因素(pH值)影響最小，根據平均值大小可知最優組合為A1B3C3D3，即B5培養基中，當蔗糖質量濃度為40g/L，激素質量濃度為2.0mg/L NAA＋0.2mg/L 6-BA，pH5.5，接種量40g/L時，最有利于懸浮培養細胞的生長和活性物質的形成，所得黃酮類化合物凈產量為147.84mg/L。

表2 B5培養基組分L9(34)正交試驗設計與結果分析Table 2 L9(34) orthogonal array design arrangement and experimental results

2.2 大花金挖耳細胞懸浮培養系的優化

2.2.1 B5培養基中激素配比對大花金挖耳細胞懸浮培養的影響

將繼代在B5+2.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA(pH5.5，蔗糖40g/L)培養基中3代的懸浮細胞接種于表3所設計的一系列培養基上。結果表明大花金挖耳懸浮培養細胞在不同質量濃度的NAA和6-BA激素組合的B5培養基中均可生長并產生黃酮類化合物。高質量濃度的NAA、6-BA不利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生，其中懸浮培養于B5+3.0mg/L NAA+0.4mg/L 6-BA中的細胞生物量、黃酮類化合物得率和產量均低于其他處理。低質量濃度的NAA、6-BA有利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生，當NAA質量濃度為1.0mg/L、6-BA在0.1～0.3mg/L時，細胞生物量在19.75～19.98g/L之間，黃酮類化合物得率最高達0.97%，黃酮類化合物產量最高達193.22mg/L，顯著高于其他處理。

2.2.2 MS培養基中激素配比對大花金挖耳細胞懸浮培養的影響

表3 B5培養基中不同激素質量濃度組合對細胞懸浮培養的影響Table 3 Effect of concentrations of NAA and 6-BA in B5 medium on cell biomass and flavonoid production

表4 MS培養基中不同激素質量濃度組合對細胞懸浮培養的影響Table 4 Effect of concentrations of NAA and 6-BA in MS medium on cell biomass and flavonoid production

表4結果表明，大花金挖耳懸浮培養細胞在不同質量濃度的NAA和6-BA激素組合的MS培養基中均可生長和產生黃酮類化合物。當NAA質量濃度為1.0mg/L時，隨6-BA在0.1～0.8mg/L范圍內質量濃度的不斷升高，細胞生物量、黃酮類化合物得率及產量有先上升后下降的趨勢，其中MS+ 1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA中的細胞生物量、黃酮類化合物得率及產量顯著高于其他處理，分別為20.54g/L、0.9891%、202.02mg/L，MS+ 1.0mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA培養基中培養細胞的黃酮類化合物得率及產量最低，分別為0.7228%、113.48mg/L；當NAA質量濃度為2.0～3.0mg/L時，隨6-BA在0.1～0.4mg/L范圍內質量濃度的升高，細胞生物量、黃酮類化合物得率及產量都有顯著下降的趨勢，其中MS+ 3.0mg/L NAA+0.4mg/L 6-BA中的細胞生物量最低為14.74g/L。可見低質量濃度的NAA、6-BA有利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生，高質量濃度的NAA、6-BA不利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生。

2.2.3 NT培養基中激素配比對大花金挖耳細胞懸浮培養的影響

表5 NT培養基中不同激素質量濃度組合對細胞懸浮培養的影響Table 5 Effect of concentrations of NAA and 6-BA in NT medium on cell biomass and flavonoid production

表5結果表明，大花金挖耳懸浮培養細胞在1.0～3.0mg/L NAA和0.1～0.8mg/L 6-BA激素組合的NT培養基中均可生長和產生黃酮類化合物。較低質量濃度的NAA、6-BA有利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生，在NT+1.0mg/L NAA+0.1～0.3mg/L 6-BA培養基中，細胞收獲量保持在22.67～23.56g/L，顯著高于NT+1.0mg/L NAA+0.4～0.8mg/L 6-BA，其中NT+ 1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA培養基中細胞黃酮類化合物得率及產量分別達1.22%、283.95mg/L，顯著高于所有處理；高質量濃度的NAA、6-BA不利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生，其中NT+ 3.0mg/L NAA +0.4mg/L 6-BA和NT+1.0mg/L NAA +0.8mg/L 6-BA培養基中懸浮培養細胞生物量、黃酮類化合物得率及產量低于其他處理。綜合分析可知NT+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA最有利于大花金挖耳懸浮培養細胞的生長和黃酮類化合物的產生。

2.3 VB1對大花金挖耳懸浮培養細胞生長和黃酮類化合物合成的影響

圖1 VB1質量濃度對懸浮培養細胞生長(a)和黃酮類化合物合成(b)的影響Fig.1 Effect of VB1concentration in NT medium on cell biomass and flavonoid production

由圖1可知，向NT培養基中添加0.5、1.0、2.0、4.0、6.0mg/L VB1時，發現當VB1在0.5～6.0mg/L范圍內變化時，細胞凈生長量先升后降，VB1在1.0～4.0mg/L范圍內，細胞凈生長量維持在21.62～22.34g/L，以含2.0mg/L VB1的培養基中細胞凈生長量最高，可達22.34g/L，NT培養基中隨VB1質量濃度的增加，黃酮類化合物得率先升后降，含1.0～4.0mg/L VB1的培養基細胞黃酮類化合物得率穩定在1.22%左右，含過高或過低質量濃度VB1的培養基對細胞生長和黃酮類化合物合成都不利，1.0～4.0mg/L VB1的培養基有抑制細胞褐化的趨勢，有利于大花金挖耳懸浮培養細胞繼代培養。

2.4 大花金挖耳懸浮培養細胞生長和黃酮類化合物形成的時間進程

由圖2可知，在NT培養基中懸浮培養的大花金挖耳細胞生長和黃酮類化合物的合成大致呈S形，大花金挖耳黃酮類化合物的積累和細胞生長具有偶聯的特性，

第0～3天為滯后生長期，細胞生物量低，3～15d為快數生長期，細胞生物量和黃酮類化合物得率逐漸升高，15～21d為靜止期，細胞生長緩慢，黃酮類化合物得率變化較穩定，細胞生物量為23.54～24.51g/L，黃酮類化合物得率為1.19～1.23%，黃酮類化合物產量達279.90～301.77mg/L，21～24d為衰亡期，細胞生物量和黃酮類化合物得率開始下降。

圖2 懸浮培養細胞生長和黃酮類化合物合成累積曲線Fig.2 Curves of suspension cell growth and flavonoides accumulation in NT medium

3 討 論

不同種類的培養基對植物培養細胞生長和次生產物的形成有很大的影響[16]。培養基一方面要滿足植物細胞的生長，同時還要使細胞能合成和積累多的次生產物。研究表明大花金挖耳懸浮培養細胞在MS、B5、NT三種培養基中均能生長并合成活性物質，這與3種培養基組分大致相似有關，其中NT培養基較MS和B5培養基更有利于大花金挖耳細胞生長和活性物質的生物合成，可能與NT培養基的總氮水平低于MS，硝態氮與銨態氮的配比低于B5有關；另外，已知KH2PO4、MgSO4等在細胞培養及微生物發酵中的初生、次生代謝發揮著重要的作用[17]，高質量濃度的MgSO4和KH2PO4也可能是NT較MS和B5培養基較有利于大花金挖耳細胞生長和活性物質的生物合成原因。以上說明了對大花金挖耳細胞培養的培養基組分進行進一步優化的必要性。

4 結 論

懸浮培養是植物細胞大規模培養的基礎[18]，而愈傷組織高產系在進入懸浮培養后有可能出現次生代謝物合成能力的降低、消失等不穩定現象[19]，因此建立并優化培養條件是得到穩定高產懸浮系的首要任務。本研究以產生黃酮類化合物能力較強的大花金挖耳根源愈傷組織為材料[13]，以正交試驗的方法研究了蔗糖質量濃度、激素、pH值、接種量等培養條件對大花金挖耳細胞懸浮培養的綜合影響，進而進行了不同培養基和激素組合及添加VB1對大花金挖耳懸浮培養細胞生長和黃酮類化合物的合成的影響，研究發現NT培養基中附加低質量濃度的NAA 1.0mg/L和6-BA 0.2mg/L對大花金挖耳細胞生長和次生代謝物的合成均有促進作用，實驗所建立的大花金挖耳細胞懸浮系在0～24d的培養時間內細胞生長和黃酮類化合物的合成大致呈S形，其中接種后第15～21天細胞生物量為23.54～24.51g/L，黃酮類化合物得率為1.19%～1.23%，黃酮類化合物產量達279.90～301.77mg/L，上述研究可為下一步提高大花金挖耳懸浮培養生產黃酮類化合物的能力的生理生化調控提供參考。

[1]延璽, 劉會青, 鄒永青. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J].有機化學, 2008, 28(9): 1534-1544.

[2]龍海榮, 楊洋, 劉紹州, 等. 黃酮類化合物的安全性研究進展[J]. 食品研究與開發, 2008, 29(10): 154-157.

[3]鄧保煒, 杜芳艷. 花生蔓中總黃酮含量的測定[J]. 食品科學, 2006, 27(12): 649-650.

[4]中國科學院西北植物研究所. 秦嶺植物志: 第一卷[M]. 北京: 科學出版社, 1985: 210.

[5]YANG C, SHI Y P, JIA Z J. Sesquiterpene lactone glycosides, eudesmanolides, and other constituents from Carpesium macrocephalum [J]. Planta Medica, 2002, 68(7): 626-630.

[6]馮俊濤, 蘇祖尚, 王俊儒, 等. 大花金挖耳花蕾中精油的化學組成及其殺菌活性研究[J]. 西北植物學報, 2007, 27(1): 156-162.

[7]謝宗萬, 余友芩. 中國中醫研究院中藥研究所.全國中草藥名鑒[M].上海: 人民衛生出版社, 1996: 756.

[8]郝雙紅, 祝木金, 馮俊濤, 等. 35種菊科植物除草活性初步測定[J].西北農林科技大學學報, 2005, 32(5): 22-26.

[9]李玉平, 龔寧, 江志利, 等. 大花金挖耳殺菌活性的進一步研究[J].西北農林科技大學學報, 2004, 32(2): 35-38.

[10]夏濤, 高麗萍. 類黃酮及茶兒茶素生物合成途徑及其調控研究進展[J]. 中國農業科學, 2009, 42(8): 2899-2908.

[11]崔興華, 李興林, 蔡津, 等. 黑暗培養條件下甘薯懸浮細胞黃酮類物質積累的初步研究[J]. 浙江大學學報: 農業與生命科學版, 2008, 34 (5): 502-508.

[12]李波, 肖靜, 李鐵, 等. 不同條件對苜蓿愈傷組織異黃酮含量的影響(簡報)[J]. 草地學報, 2007, 15(5): 500-502.

[13]李玉平, 姜在民, 馮俊濤, 等. 不同培養條件對大花金挖耳愈傷組織生長及黃酮產量的影響[J]. 核農學報, 2008, 22(3): 286-290.

[14]朱至清. 植物細胞工程[M]. 北京: 化學工業出版社, 2003: 206-209.

[15]李玉平, 王永宏, 易曉華, 等. 大花金挖耳細胞培養物中總黃酮的檢測[J]. 安徽農業科學, 2007, 35(29): 9160-9161.

[16]FUJITA Y, HARA Y, SUGA C, et al. Production of shikonin derivatives by cell suspension cultures of Lithospermum erthrorhizon[J]. Plant Cell Report, 1981, 2(4): 61-63.

[17]WANG Yonghong, LI Yuping, ZHANG Qiang, et al. Enhanced antibiotic activity of Xenorhabdus nematophila by medium optimization[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6): 1708-1715.

[18]LOC N H, TUAN V C, BINH D H N, et al. Accumulation of sesquiterpenes and polysaccharides in cells of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe) cultured in a 10 L bioreactor[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2009, 14(5): 619-624.

[19]QU Junge, ZHANG Wei, YU Xingju, et al. Instability of anthocyanin accumulation in Vitis vinifera L. var. Gamay Fr é aux suspension cultures[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2005, 10(2): 155-161.

Optimization of Cell Suspension Culture of Carpesium macrocephalum for Flavonoid Production

LI Yu-ping1,2，GONG Ning3，WANG Yong-hong1，FENG Jun-tao1，ZHANG Xing1,*
(1. Research and Development Center of Bioratioual Pesticide, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；3. College of Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The goal of the present study was to optimize the culture conditions for the establishment of suspension cell lines from Carpesium macrocephalum callus. The effects of medium type, concentrations of sucrose, VB1, NAA and 6-BA, initial pH value, inoculum quantity and culture time on cell biomass and flavonoid production were examined. The optimal conditions for culture in NT liquid medium conducive to both cell growth and flavonoid production were as follows: initial pH, 5.5, inoculum quantity, 40 g/L; NAA concentration, 1.0 mg/L; and 6-BA concentration, 0.2 mg/L. Cell browning was inhibited by adding 1.0－4.0 mg/L of VB1. Both the growth of Carpesium macrocephalum cells and the synthesis of flavonoids trended to first ascend and then descent with prolonged culture time. A cell biomass ranging from 23.54 to 24.51 g/L was achieved at 15－20 d post-inoculation, and the yield of flavonoids was between 1.19% and 1.23%.

Carpesium macrocephalum；cell suspension culture；biosynthesis；flavonoid

R284.2

A

1002-6630(2010)21-0239-05

2010-02-26

國家自然科學基金項目(30971934)；“十五”國家科技攻關重大專項(2002BA516A04)

李玉平(1970—)，男，副教授，博士，主要從事藥用植物資源研究。E-mail：liyuping1970@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：張興(1952—)，男，教授，博士，主要從事生物農藥研究。E-mail：zhxing1952@126.com