銀條多酚氧化酶特性及控制的研究

郭香鳳

銀條多酚氧化酶特性及控制的研究

郭香鳳

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

對銀條多酚氧化酶(PPO)的酶學特性及控制進行研究。結果表明：銀條PPO的最適反應時間為2.0min，最適pH值為5.0，最適溫度為30℃，銀條PPO的熱穩定性較差。抗壞血酸(VC)、L-半胱氨酸(L-cys)、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉等對PPO活性均有極顯著地抑制作用；在0.05g/100mL 檸檬酸+0.05g/100mL 抗壞血酸+0.05g/100mL L-半胱氨酸復合化學抑制劑作用條件下，對銀條PPO的酶活性抑制率可達93.5%。

銀條；多酚氧化酶；酶活力；抑制率；控制

銀條是河南省偃師市的名優地方特產蔬菜，以其色白、質脆、口味清香等優良品質而深受國內外消費者的喜愛。然而銀條采后貯藏和加工過程中的褐變是影響其商品品質和制約其經濟發展的重要因素，這與多酚氧化酶(PPO)催化的酶促反應有關。尋求抑制PPO活性的有效措施一直是PPO研究的熱點之一[1]。對馬鈴薯[2]、花椰菜[3]、蓮藕[4]、雪梨[5]、芋艿[6]、大蒜[7]、茄子[8]、蘋果[9]、山藥[10]等多種植物組織PPO的酶學特性研究表明：不同植物組織的PPO性質因植物種類、品種、酶促反應條件及各種化學物質影響的不同而異[11]。但有關銀條PPO特性的研究尚未見報道。因此，本實驗以新鮮銀條為材料，對其PPO的酶學特性及控制措施進行研究，探討其酶促反應基本條件以及不同抑制劑對其活性的影響，以期有效控制銀條采后貯藏和加工過程中的褐變和商品品質，為進一步擴大銀條的生產規模、提高貯藏和加工品質、延長銀條產品的貨架壽命等提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮銀條采自河南省偃師市，當日采收后立即運回實驗室處理備用。

檸檬酸(CA)、抗壞血酸(VC)、L-半胱氨酸(L-cys)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)等均為分析純，食鹽(NaCl)為食品級。

1.2 儀器與設備

722-S型分光光度計 上海市精密科學儀器有限公司；EPH522酸度計 上海宇隆儀器有限公司；KDC-16H高速離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；HH-W420數顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；202型電熱恒溫干燥箱 北京市永光明醫療儀器廠；BS-200S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1銀條中PPO粗酶液的提取

參照趙玉宏[10]的方法略加改進。將新鮮銀條洗凈、瀝干、沾凈水分后，隨機取30g樣品，加入約10mL預冷后的pH7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，冰浴研磨至勻漿后，全部轉移至100mL棕色容量瓶中定容，于4℃冰箱中靜置提取15min后，過濾，濾液于4℃、8000r/min條件下離心20min，上清液即為銀條PPO粗酶液，于4℃冰箱中貯藏備用。

1.3.2 銀條PPO基本特性的測定

1.3.2.1 銀條PPO最大吸收波長

參考高愿軍等[4]的方法，將酶與鄰苯二酚的反應產物在380～450nm波長范圍內掃描，確定銀條PPO的最大吸收波長為410nm。

1.3.2.2 銀條PPO活性

以鄰苯二酚為底物，在3.0mL反應體系中，加入2.7mL最適pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.2mL 0.1mol/L鄰苯二酚、0.1mL銀條PPO粗酶液，于最適溫度下保溫一定時間后立即于最大吸收波長處測定反應產物的OD值。實驗重復3次。以OD值表示銀條PPO的相對酶活力[12]。

1.3.2.3 銀條PPO反應進程曲線的繪制

參照1.3.2.2節的方法，室溫(14℃)下分別在1.0～10.0min范圍內(間隔1.0min)測定PPO的OD值，繪制出PPO反應進程曲線。實驗重復3次。

1.3.2.4 pH值對銀條PPO活性的影響

在3.0mL反應體系中分別加入2.7mL pH值為2.0～8.0 (間隔1.0)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，在室溫(14℃)下反應2.0min測定其OD值。實驗重復3次。

1.3.2.5 溫度對銀條PPO活性的影響

將反應液分別在20～50℃(間隔5℃)恒溫條件下反應2.0min后，測定其OD值。實驗重復3次。

1.3.2.6 銀條PPO熱穩定性的測定

在3.0mL反應體系中加入2.7mL pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.1mL銀條PPO粗酶液，將混合液置于90℃水浴中，分別加熱0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0min后立即冷卻至30℃，加入0.1mL 0.1mol/L鄰苯二酚反應2.0min后測定OD值。實驗重復3次。

1.3.2.7 酶添加量對銀條PPO活性的影響

分別在3.0mL反應體系中加入0.1、0.2、0.3、0.4mL銀條PPO粗酶液反應后，測定其OD值。實驗重復3次。

1.3.3 不同抑制劑對銀條PPO活性的影響

參照1.3.2.2節的方法，分別在3.0mL反應體系中加入0.2mL不同質量濃度的CA、L-cys、NaCl、VC、Na2SO3、NaHSO3、EDTA-2Na等抑制劑反應后，測定其處理后的殘留酶活性。用去離子水作對照，以相對抑制率[13]為指標，進行抑制效果的比較和較優抑制劑水平的選擇。然后選擇其中抑制效果較好的VC、L-cys配合成本較低的CA進行三因素三水平正交試驗，篩選最優抑制劑組合。實驗重復3次。

1.4 數據分析

所有數據均采用DPS v7.05軟件統計分析。

2 結果與分析

圖1 銀條PPO反應時間進程曲線Fig.1 Time course of hydrolysis catalyzed by PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

2.1 銀條PPO反應時間進程曲線如圖1所示，反應最初2.0min內酶活力變化很快，2.0min時酶活力達到最大值0.703，以后隨著反應進程的進行，反應速度快速下降，可能與酶反應產物積累對酶的抑制有關。故本試驗選擇2.0min作為銀條PPO最適反應時間。銀條PPO的時間反應曲線提示：在貯藏和加工實踐中，應在銀條組織和細胞遭到破壞(如加工中高壓水清洗造成的銀條表皮破損和斷條造成的傷口等)的同時快速采取措施才能有效地抑制酶促褐變的發生。

2.2 pH值對銀條PPO活性的影響

圖2 pH值對銀條PPO活性的影響Fig.2 Effect of pH on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖2所示，在pH2～8不同酸堿條件下，銀條PPO活性差別較大。pH≤4.0酸性范圍內，隨pH值升高銀條PPO活力急劇升高，pH2.0時酶活力僅為最適pH值

時的9.28%，表明酸對其活性的影響較大，生產上可以考慮通過加酸處理來抑制銀條PPO的活性；當pH值達到5.0時酶活力升至高峰，由此判斷其最適pH值為5.0。當pH≥6.0時，隨pH值的繼續升高，PPO活性逐漸降低。這種酶在酸堿條件下活性的變化，與其含銅蛋白有關；在pH值較低的酸性環境中，酶活性中性中的銅被解離出來，使酶活性降低，而在堿性條件下銅會解離形成氧化銅，使酶活性下降[8,14]。故本試驗選擇pH5.0為銀條PPO最適pH值。

作為地下根莖類蔬菜，銀條PPO的最適pH值與紫甘薯[15](最適pH4.1和6.0)、普通甘薯[16](最適pH4.4和6.4)、蓮藕[4](最適pH7.0)、淮山藥[13](最適pH6.0)、葛根[17](最適pH7.0)等有所不同。

2.3 溫度對銀條PPO活性的影響

圖3 溫度對銀條PPO活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖3所示，在20～50℃范圍內，30℃時銀條PPO的反應活性最高，此后隨溫度的繼續升高，酶活力急劇下降，表明銀條PPO對溫度反應敏感，生產上可以通過控制反應溫度有效地控制酶促褐變[8]。

2.4 酶添加量對銀條PPO活性的影響

圖4 加酶量對銀條PPO活性的影響Fig.4 Effect of enzyme loading on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖4所示，銀條PPO活性與粗酶液添加量呈正相關，隨加酶量的增加而顯著升高(P＜0.05)。考慮到OD的取值范圍，本試驗選擇0.1mL為最適加酶量。

2.5 銀條PPO的熱穩定性

如圖5所示，在9 0℃恒溫加熱處理條件下，隨著加熱時間的延長，銀條PPO活性極顯著地下降(P＜0.01)，表明其熱穩定性較差。加熱0.5min時酶活力下降了29%，加熱3min時，酶活力急劇下降至原來的29.3%；其后隨加熱時間的繼續延長，酶的活性基本趨于穩定，加熱5min時對酶活的抑制率達到75.4%。表明加熱可以極顯著地鈍化銀條PPO的活性，但不能徹底抑制酶的作用，且新鮮銀條質地脆嫩、組織結構疏松，長時間加熱易引起質地軟爛影響成品口感和形狀，故銀條加工中在進行短時熱處理(燙漂)的同時需要輔助其他措施來加強酶促褐變抑制效果。

圖5 熱處理對銀條PPO活性的影響Fig.5 Effect of thermal treatment on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

2.6 不同抑制劑對銀條PPO活性的影響

表1 不同抑制劑對銀條PPO活性抑制作用比較Table 1 Comparison on inhibition effects of different inhibitors on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

CA、VC、L-cys、EDTA-2Na、Na2SO3、NaHSO3、NaCl幾種常用化學物質對銀條PPO酶活抑制結果見表1。由表1可知，本試驗所篩選的幾種化學物質對銀條PPO活性均有一定的抑制作用，以Na2SO3、NaHSO3、VC和L-cys四種常用抑制劑對銀條PPO的抑制能力較強；而CA、NaCl、EDTA-2Na這3種物質的抑制能力相對較弱。

鑒于使用亞硫酸鹽類存在一些產生異味、破壞營養、影響哮喘病人健康等弊端而被限制使用[17]，而CA中羰基可與多酚氧化酶的銅離子產生比較強的螯合作用[13]、VC既可作為PPO的競爭性抑制劑又可氧化漂白色素[18]、L-cys[19]能夠與酶促反應產物醌類結合從而抑制酶促褐變，因此，生產上可以考慮采用VC、L-cys、CA等取代硫處理而作為控制銀條酶促褐變的化學抑制劑使用。

2.7 銀條PPO抑制劑正交試驗

在上述單因素試驗基礎上，選擇VC、L-cys、CA為因素進行L9(34)正交試驗，尋求各因素之間的協同抑制效應。試驗結果見表2～4。

表2 銀條PPO抑制劑正交因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing formulation of a compound inhibitor for PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

表3 正交試驗極差分析Table 3 Range analysis for orthogonal array experimental results

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis for orthogonal array experimental results

由表3可知，各因素對銀條PPO活性抑制強弱順序為：抗壞血酸＞檸檬酸＞L-半胱氨酸。且抑制作用均達到極顯著水平(P＜0.01)(表4)。

根據極差分析結果(表3)，以各抑制劑因素組合對銀條PPO酶活力抑制的OD值較小者為最佳水平，得到的較優組合為A3B3C3，考慮到降低成本的需要，在VC、L-cys水平不變、對PPO的抑制能力達到90%以上的前提下，將其與正交組合中抑制效果最好的組合A1B3C3進行比較實驗，A3B3C3組合處理后銀條PPO酶反應的平均OD410nm值為0.046，略低于A1B3C3處理的(0.048)，但兩者之間差異不顯著，故本試驗選擇A1B3C3為抑制劑最佳組合，即0.05g/100mL檸檬酸+0.05g/100mL抗壞血酸+0.05g/100mL L-半胱氨酸，此條件下對銀條PPO的酶活抑制率可達93.5%。

3 結 論

3.1 銀條PPO的最大吸收波長為410nm；最適反應溫度為30℃；其最適反應時間2.0min，隨反應時間延長其酶活力下降，加工中應在銀條高壓水清洗操作階段就應開始護色處理；最適pH值為5.0，當體系pH≤4.0或者pH≥6.0時，能有效降低銀條PPO活性。

3.2 銀條PPO的熱穩定性較差，90℃恒溫加熱3.0min可使酶活下降至原來的29.3%；加熱5.0min時75.4%的酶活性喪失。故銀條加工中可以考慮將短時燙漂處理與其他抑制酶促褐變的措施相結合提高防褐變效果。

3.3 亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸等常規化學抑制劑對銀條PPO活性有極顯著的抑制作用；可在0.05g/100mL檸檬酸+0.05g/100mL抗壞血酸+ 0.05g/100mL L-半胱氨酸的條件下對銀條PPO的酶活抑制率達到93.5%。

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Enzymatic Characterization and Inactivation of Polyphenol Oxidase from Stachys floridana Schuttl.ex Benth

GUO Xiang-feng
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The enzymatic properties of polyphenol oxidase (PPO) extracted from Stachys floridana Schuttl.ex Benth were characterized. Meanwhile, the inactivation of this enzyme by thermal treatment or adding chemical inhibitors was investigated, and a compound inhibitor composed of three selected chemical inhibitors (citric acid, vitamin C and L-cysteine) was developed and its formulation was optimized. The optimal reaction pH, time and temperature conditions for PPO activity were 5.0, 2.0 min and 30 ℃, respectively. Color preserving agents such as ascorbic acid, L-cystenine, citric acid, NaHSO3, Na2SO3 had a significant inhibitory effect on PPO activity. The optimal combinatorial formula was composed of 0.05 g/100mL citric acid, 0.05 g/100mL vitamin C and 0.05 g/100mL L-cysteine, and the resultant enzyme inhibition rate reached up to 93.5%.

Stachys floridana Schuttl.ex Benth；polyphenol oxidase；PPO activity；inhibition rate；control

TS201.21

A

1002-6630(2010)21-0316-04

2010-06-11

郭香鳳(1964—)，女，副教授，碩士，研究方向為農產品保鮮加工。E-mail：gxfeng40@163.com