富硒沼澤紅假單胞菌G3菌與牛初乳復配改善小鼠免疫功能的作用研究

楊啟銀，王家芳，賈秉晟，管海華，劉 青

富硒沼澤紅假單胞菌G3菌與牛初乳復配改善小鼠免疫功能的作用研究

楊啟銀1,2,3，王家芳1，賈秉晟1，管海華1，劉 青1

(1. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；2. 南京市微生物工程技術研究中心，江蘇 南京 210046；3. 江蘇省微生物資源工程化技術研究中心，江蘇 南京 210046)

目的：探討富硒沼澤紅假單胞菌G3菌(簡稱富硒G3菌)與牛初乳復配對小鼠免疫功能的影響。方法：將富G3菌與牛初乳復配形成富硒牛初乳，用環磷酰胺構建小鼠免疫低下模型，對免疫低下小鼠灌胃富硒G3菌、牛初乳和富硒牛初乳，50d后測定各組小鼠臟器指數、白細胞數、T淋巴細胞陽性率、血清SOD酶活性、全血GSH-Px活性，同時計算平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值。結果：富硒G3菌、牛初乳、富硒牛初乳均能提高免疫低下小鼠對飼料的利用率，能提高免疫低下小鼠SOD、GSH-Px活性、白細胞數和T淋巴細胞陽性率，其中富硒牛初乳高劑量組效果最為明顯，說明富硒牛初乳高劑量組能顯著增強小鼠的免疫功能。

硒；牛初乳；沼澤紅假單胞菌；環磷酰胺；免疫功能

牛初乳是奶牛正常分娩后一周內分泌的乳汁，初乳中營養物質十分豐富，并含有多種特殊的生理活性物質，主要分為免疫活性因子和生長因子兩類。研究表明，初乳不僅可以提供幼畜生長發育所必需的營養成分，而且還具有提高免疫力、改善胃腸道、提高生產性能等作用[1-3]。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是紅螺菌科紅假單胞菌屬的一種。由于沼澤紅假單胞菌含有豐富的營養活性成分及其獨特的生物轉化功能，已應用于乳酸飲料和酒類中，成為一種新的食品資源和飼料資源[4]。近年來它的免疫調節、抗氧化作用也引起人們的關注。硒(Se)是人體必需的微量元素，體內缺硒會引起多種疾病。補硒可激活體液和細胞免疫能力，從而起到抗癌作用，補硒也能改善肝臟功能，促進肝細胞的再生[5-10]。富硒沼澤紅假單胞菌是以還原

態的硒化物作為電子供體培養而成的一種含有有機硒化合物的菌體[11]。沼澤紅假單胞菌本身營養豐富，含有多種活性成分[12]，并且是唯一由國家農業部批準作為飼料添加劑使用的光合細菌[13]。目前，國內用富硒沼澤紅假單胞菌與牛初乳復配改善小鼠免疫力低下的研究尚未見報道。

本實驗用沼澤紅假單胞菌作為一種新的轉化有機硒的載體，將富硒沼澤紅假單胞菌G3菌與牛初乳復配形成富硒牛初乳，初步探討富硒牛初乳對環磷酰胺所致小鼠免疫低下的影響，為微生物富硒與牛初乳復配進行保健品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛初乳凍干粉(簡稱牛初乳)，免疫球蛋白含量21%，由江蘇吳中大自然生物工程有限責任公司提供；沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)G3(本實驗室保存)；富硒沼澤紅假單胞菌G3(本實驗室制備)；富硒牛初乳(本實驗室制備)；注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥有限公司。

昆明種小鼠，雄性129只，雌性33只，體質量(20±2)g，購于南京中醫藥大學動物繁殖中心。

FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Centrifuge5804R離心機 德國Eppendorf公司；CHA-213生物顯微鏡 日本Olympus公司；UV757紫外-可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 富硒沼澤紅假單胞菌G3的制備

采用分批補硒補料方法制備富硒G3菌：挑取耐硒G3菌單菌落于液體培養基做種子活化液，120h后將種子活化液按5%的接種量接種于裝液量為200mL的250mL的具塞三角瓶中，于接種后12h加硒，使培養基亞硒酸鈉濃度達到4×10-5mol/L，在培養過程的36h和48h分別補料，并在36h補硒，使培養基亞硒酸鈉總濃度達到5×10-5mol/L，制備富硒G3菌。

沼澤紅假單胞菌的營養成分、B族維生素含量和類胡蘿卜素含量見參考文獻[12]。

1.2.2 富硒牛初乳

按照1.2.1節方法制備富硒G3菌，5000r/min離心30min，用雙蒸水反復沖洗去除游離無機硒，收集菌體，烘干研磨后備用，有機硒含量847.42μg/g。富硒G3菌與牛初乳復配，按m(富硒G3菌):m(牛初乳)=1:20000配制成富硒牛初乳。

1.2.3 環磷酰胺誘導小鼠免疫力低下模型[14-19]

小鼠正常飼養3 d后隨機分組，分為空白對照組(A)、免疫低下模型組(B)、富硒G3菌低劑量組(C，硒劑量為0.833μg/kg bw)、富硒G3菌高劑量組(D，硒劑量為8.333μg/kg bw)、牛初乳低劑量組(E，灌胃劑量為0.017g/kg bw)、牛初乳高劑量組(F，灌胃劑量為0.167g/kg bw)、富硒牛初乳低劑量組(G，灌胃硒劑量為0.833μg/kg bw、灌胃牛初乳劑量為0.017g/kg bw)、富硒牛初乳高劑量組(H，灌胃硒劑量為8.333μg/kg bw、灌胃牛初乳劑量為0.167g/kg bw)，灌胃體積均為5mL/kg bw。每天灌胃一次，灌胃4 7 d。

小鼠共分為8組，每組12只。每10d定時稱量體質量一次，頸背部皮下注射環磷酰胺(空白對照組注射生理鹽水)，每天更換墊料，記錄小鼠健康以及發病情況，定時稱量給料量及剩料量，計算平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值。實驗共進行50d，實驗結束時，取空腹16h的小鼠尾血測定T淋巴細胞陽性率，摘眼球取血處死，測定白細胞數，全血GSH-Px酶活性、血清S O D酶活性，取肝臟、脾臟、胸腺、腎臟，去除結締組織后稱質量，計算臟器指數。

1.2.3.1 小鼠平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值測定

實驗期間，每10d定時稱小鼠體質量，每天定時稱量給料量及剩料量，計算平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值。

平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值(F/G)=平均日采食量/平均日體質量增加量 (1)

1.2.3.2 小鼠臟器指數

實驗結束時，取空腹16h小鼠的肝臟、脾臟、胸腺、腎臟，去除結締組織后稱質量，計算臟器指數。

肝臟指數=(肝臟質量/體質量)×100 (2)

腎臟指數=(腎臟質量/體質量)×100 (3)

“辦公自動化系統使一線醫務人員足不出戶即可完成大量行政審批申請工作，可實時查詢各節點審批情況，審批完成后自動歸檔到各歸口科室進行辦理，讓我們的醫務人員有更多的時間為患者提供更多的優質服務。”

脾臟指數=(脾臟質量/體質量)×100 (4)

胸腺指數=(胸腺質量/體質量)×100 (5)

1.2.3.3 小鼠血清SOD酶活力及全血GSH-Px活性測定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.2.3.4 小鼠白細胞數[14,20]

在2mL離心管中加入0.38mL白細胞稀釋液，準確吸取全血20μL，擦去槍頭外壁余血，將槍頭插入離心管中稀釋液的底部，輕輕將血放出，并吸取上清液清洗多次，混勻。待紅細胞完全破壞，液體變成棕褐色后，再次混勻后滴入血球計數板中，靜置2～3min，待白細胞下沉，用低倍鏡計數白細胞總數(個/L)。

白細胞數/(個/L)= N/4×10×20×106(6)式中：N為4個大方格內白細胞總數。

1.2.3.5 小鼠T淋巴細胞陽性率[21-23]

取鼠尾血一滴至潔凈載玻片一端，推成厚薄適當的

血片，冷風迅速吹干→將血片置冷的福爾馬林-丙酮固定液中，4℃固定1min→取出血片用自來水沖洗3min，再用雙蒸餾水將玻片上剩余的自來水沖掉，冷風迅速吹干→將經過固定、沖洗并干燥后的血片放入孵育液中，37℃孵育2h→取出血片立即在自來水中沖洗3min，再用蒸餾水沖洗，以除去血片上的沉淀物→用孔雀綠染色液將血片復染1min左右，雙蒸餾水先后沖洗，晾干，油鏡觀察、計數100個淋巴細胞，求出酯酶染色(ANAE)陽性細胞百分數。

1.2.4 數據處理與分析

數據的統計處理采用Origin 6.0軟件進行方差分析，結果以平均數±標準差(x±s)表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠生長性能

圖1 不同飼養階段各組日平均每日進食飼料質量與體質量增加量的比值變化Fig.1 Change of F/G in each group during different feeding periods

由圖1可以看出，在0～10d的飼養階段，各組間F/G差別不大。在飼養10～20d時B組的F/G開始均高于A組及各處理組，說明B組對飼料的利用率不高，其他各處理組能夠較好地吸收利用飼料，在飼養30～50d時B組的平均F/G越來越高，是C組的1.93倍、D組的3.36倍、E組的1.42倍、F組的3.23倍、G組的2.5倍、H組的3.59倍，說明免疫功能低下的B組對飼料的利用率越來越低。

2.2 小鼠臟器指數

由表1可以看出，B組各項臟器指數普遍比A組和各處理組低，說明環磷酰胺對小鼠的生理功能有一定的影響。比較A組與B組各臟器指數，差異極顯著(P＜0.01)，說明免疫功能低下模型成功。比較C、D、E、F、G、H組與B組的差異性，各項臟器指數均高于B組，其中脾臟指數最明顯，各處理組均高于B組，C組和E組差異顯著(P＜0.05)，D、F、G、H組差異極顯著(P＜0.01)；比較H組與B組的肝臟、腎臟、脾臟和胸腺指數，H組明顯高于B組，超過了A組水平，與B組差異極顯著(P＜0.01)。實驗結果表明， C、D、E、F、G組和H組的各項臟器指數增加，其中以H組的效果最為明顯。

表1 富硒牛初乳對免疫低下小鼠臟器指數的影響±s)Table 1 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on organ index of immunodepressed mice (±s)

表1 富硒牛初乳對免疫低下小鼠臟器指數的影響±s)Table 1 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on organ index of immunodepressed mice (±s)

注：*.與免疫低下模型組比較，差異顯著(P＜0.05)；**.與免疫低下模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別肝臟指數腎臟指數脾臟指數胸腺指數A5.003±0.301**1.280±0.057**0.374±0.021**0.234±0.007** B4.384±0.2681.204±0.0350.297±0.0210.180±0.012 C4.441±0.1681.224±0.0270.322±0.027*0.184±0.006 D4.919±0.165**1.262±0.043**0.338±0.009**0.187±0.006 E4.412±0.0771.219±0.0310.314±0.005*0.182±0.002 F4.883±0.179**1.265±0.029**0.334±0.009**0.186±0.005 G4.721±0.151**1.243±0.035*0.321±0.005**0.186±0.006 H5.010±0.113**1.287±0.023**0.380±0.024**0.244±0.007**

2.3 小鼠血清SOD酶活性和全血GSH-Px酶活性

表2 富硒牛初乳對小鼠血清SOD活性和全血GSH-Px活性影響±s)Table 2 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on the activities of SOD and GSH-Px in blood of immunodepressed mice±s)

表2 富硒牛初乳對小鼠血清SOD活性和全血GSH-Px活性影響±s)Table 2 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on the activities of SOD and GSH-Px in blood of immunodepressed mice±s)

組別SOD活性/(U/mL)GSH-Px活性/(U/(mL·min)) A 170.55±4.49**42.78±2.00** B 131.96±4.2634.93±1.79 C 152.08±3.9**37.90±1.26** D 167.55±8.15**41.37±3.19** E 140.27±9.65*35.88±1.86 F 160.51±1.24**37.64±2.58** G 166.17±4.75**38.98±2.84** H 195.52±8.36**43.17±1.56**

由表2可知，A組與B組血清SOD活性相比較，差異極顯著(P＜0.01)，說明免疫力低下模型成功。比較C、D、E、F、G、H組與B組小鼠的血清S O D活性差異性，各處理組血清SOD活性均有不同程度的提高，C組提高了20.12U/mL、D組提高了35.59U/mL、E組提高了8.31U/mL、F組提高了28.55U/mL、G 組提高了34.21U/mL、H組提高了63.56U/mL，與B組相比較，差異極顯著(P＜0.01)。結果表明，不同劑量的有機硒和牛初乳均能使各處理組血清SOD活性有所提高，其中H組SOD活性最高。說明H組具有較強的清除體內自由基，提高免疫能力。

比較A組與B組全血GSH-Px活性，A組比B組增加了7.85U/(mL·min)差異極顯著(P＜0.01)，說明免疫力低下造模成功。比較C、D、E、F、G、H組與B組小鼠的全血GSH-Px活性差別，各處理組GSH-Px

活性比B組均有不同程度的提高，C組提高了2.97 U/(mL·min)、D組提高了6.44U/(mL·min)、F組提高了2.71U/(mL·min)、G 組提高了4.05U/(mL·min)、H 組提高了8.28U/(mL·min)，差異極顯著(P＜0.01)；E組提高最少，僅提高了0.95U/(mL·min)，為差異不顯著(P＞0.05)。結果表明，C、D、F、G、H組均可提高小鼠全血GSH-Px活性，其中H組GSH-Px活性最高。說明H組具有較強清除體內自由基能力，改善受損傷細胞，提高免疫力。

2.4 小鼠白細胞數和T淋巴細胞陽性率

表3 富硒牛初乳對免疫低下小鼠白細胞數和T淋巴細胞陽性率的影響(±s)Table 3 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on the counts of white cells in immunodepressed mice and the population of positive T-cells (±s)

表3 富硒牛初乳對免疫低下小鼠白細胞數和T淋巴細胞陽性率的影響(±s)Table 3 Effect of selenium-enriched bovine colostrumson on the counts of white cells in immunodepressed mice and the population of positive T-cells (±s)

組別白細胞數(×109個/L)T淋巴細胞陽性率/% A 7.97±0.16**61.47±3.34** B 4.84±0.1739.89±1.98 C 5.10±0.29*42.36±2.71* D 7.86±0.25**55.03±2.44** E 5.02±0.2641.78±3.83 F 6.22±0.27**46.94±2.80** G 6.38±0.19**50.03±2.68** H 8.49±0.19**63.19±3.14**

由表3可知，比較A組與B組的白細胞數，B組比A組明顯低了3.13×109個/L，差異極顯著(P＜0.01)，說明小鼠免疫力低下。比較C、D、E、F、G組和H組與B組的白細胞數，各處理組均比B組有所提高，其中E組增加最少，僅增加了0.18×109個/L，差異不顯著；C組略有增加，增加了0.26×109個/L，差異較顯著(P＜0.05)；D、F、G、H組增加較多，差異極顯著(P＜0.01)。實驗表明，D、F、G組和H組白細胞數都明顯得到提高，其中以D組和H組最為明顯，D組與A組水平接近，H組超過A組水平，比B組增加3.65×109個/L。說明D組和H組都可以提高小鼠白細胞數。

經顯微鏡觀察T淋巴細胞在胞漿內有明顯的紫紅色圓點(有時融合成片狀的產物)一般為1～2個，有的2～4個紫紅色顆粒，此為酯酶染色陽性(即ANAE陽性)。由表3可知，與B組相比，A組T淋巴細胞陽性率比B組高，且差異極顯著(P＜0.01)，說明小鼠免疫低下。與B組相比較，各處理組T淋巴細胞陽性率均有所提高，其中C組與E組小鼠T淋巴細胞陽性率增加較少，E組與B組相比較，差異不顯著；C組與B組相比較，增加較明顯，差異較顯著(P＜0.05)；D、F、G組和H組與B組相比較，T淋巴細胞陽性率增加明顯，差異極顯著(P＜0.01)，其中H組T淋巴細胞陽性率最高，超過A組水平。結果表明，D、F、G、H組的小鼠T淋巴細胞陽性率都得到提高，尤其H組的效果最為明顯。

3 討 論

免疫抑制是由于免疫系統受到損害，導致機體對抗原的應答能力下降的一種免疫異常狀態。環磷酰胺是一種細胞毒性藥物，它能夠殺死有絲分裂和進入循環周期的細胞，具有較強的免疫抑制作用，在免疫學研究中常以環磷酰胺作為免疫抑制模型的制備藥物[15-16]。本實驗通過對小鼠飼養期間對飼料利用的分析，免疫功能低下的模型組在飼養20d后對飼料的利用率越來越低，F/G越來越高，是其他實驗組的1.42～3.59倍，說明環磷酰胺構建小鼠免疫低下模型成功。

免疫器官組織由淋巴組織組成，它是免疫細胞發生、分化、成熟的場所，也是免疫反應發生的地點，脾臟、胸腺是小鼠的免疫器官，觀察其質量的改變可以直觀地反映小鼠免疫功能的變化[24]。環磷酰胺屬于細胞周期非特異性化療藥，對增殖周期中各期細胞均有滅殺作用[25-26]，由于機體大部分白細胞壽命較短，環磷酰胺的滅殺作用首先通過白細胞反映出來[17]。通過白細胞計數和計算T淋巴細胞陽性率可以大致反映小鼠的免疫功能狀態[18-19]。本實驗比較了各實驗組的肝臟、腎臟、脾臟和胸腺指數，與模型組相比均有差異，其中富硒G3菌高劑量組、牛初乳高劑量組和富硒牛初乳高劑量組，差異極顯著(P＜0.01)。對小鼠白細胞數和T淋巴細胞陽性率的影響，除牛初乳低劑量組不明顯外，其余各組都十分明顯，其中富硒牛初乳高劑量組與模型組相比，小鼠白細胞數提高了175%、T淋巴細胞陽性率提高了158%。說明適當的劑量有改善免疫低下的作用。

SOD和GSH-Px是清除自由基的關鍵抗氧化酶，能夠保護細胞免受損傷，維護細胞膜結構完整性，增強機體的免疫功能。實驗表明，注射了環磷酰胺的免疫低下模型組與對照組相比，SOD和GSH-Px活性明顯較低，這與吳軍等[27]和曹志玲[28]報道的環磷酰胺可導致機體抗氧化能力降低的結果一致。注射環磷酰胺導致機體抗氧化能力下降，自由基產生過多，造成組織細胞膜毒性反應，影響正常組織形態和功能的完整性，抑制淋巴細胞增生分化，抑制其對刺激原的反應性及細胞的功能[29]。實驗各組小鼠的血清SOD酶活性和全血GSH-Px酶活性除低牛初乳低劑量組外都有明顯的提高，尤其富硒牛初乳高劑量組小鼠體內的S O D酶活性提高了47.77%，GSH-Px酶活性提高了23.59%，說明經復配的富硒牛初乳對清除體內的自由基，保護機體細胞免受損傷，改善免疫功能的作用優于單一牛初乳或有機硒的作用。

郭峰等[30]研究表明，在飼糧中添加酵母硒或無機硒

可提高生長前期肉雞的日增體質量，降低F/G，其中同水平的酵母硒增加量大于無機硒。添加酵母硒對生長后期肉雞體質量增加仍具有明顯提高作用，對F/G有明顯降低作用；而添加無機硒雖有提高體質量的效果，但對F/G無顯著影響。張乙山等[31]研究表明，與不加硒空白對照組相比，在基礎日糧中添加0.3、0.5、0.8mg/kg 亞硒酸鈉分別使F/G降低了6.82%、6.23%和8.61%；添加0.3、0.8mg/kg 酵母硒分別使F/G降低了5.93%和17.21%；添加0.3、0.5mg/kg 納米硒分別使F/G降低了8.31%和9.20%，酵母硒和納米硒的添加量能較大幅度降低F/G。萬善霞等[32]研究表明，飼喂仔豬牛初乳IgG能提高仔豬的生產性能。Bird等[33]報道，初乳中的表皮生長因子具有改善酸分泌、調節黏膜刷狀緣消化酶的活性、改善機體的消化吸收能力、促進機體生長的功能。比較本實驗各處理組F/G，均比免疫低下模型組低，說明免疫低下模型組飼料利用率不高，這與上述文獻報道的結果一致。

實驗結果表明，富硒G3菌、牛初乳、富硒牛初乳均能提高免疫低下小鼠對飼料的利用率，能提高免疫低下小鼠SOD、GSH-Px活性、白細胞數和T淋巴細胞陽性率，其中牛初乳高劑量組和富硒牛初乳高劑量組的效果最為明顯；比較牛初乳高劑量組和富硒牛初乳高劑量組的效果，富硒牛初乳高劑量組更為明顯，說明富硒牛初乳能顯著增強小鼠的免疫功能，但有機硒與牛初乳如何進行復配以及作用機理有待進一步研究。

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Combined Effect of Bovine Colostrumson and Selenium-enriched Rhodopseudomonas palustris G3 on Immune Function in Mice

YANG Qi-yin1,2,3，WANG Jia-fang1，JIA Bing-sheng1，GUAN Hai-hua1，LIU Qing1
(1. College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. Nanjing Engineering and Technology Research Center for Microbiology, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Microbial Resources, Nanjing 210046, China)

In order to investigate the effect of selenium-enriched bovine colostrumson on immune function of immunodepressed mice induced by cyclophosphamide, selenium-enriched Rhodopseudomonas palustris G3 (hereinafter called selenium-enriched G3) was mixed with bovine colostrumson to prepare selenium-enriched bovine colostrumson. The immunodepressed mice were treated with selenium-enriched G3, bovine colostrumson and selenium-enriched bovine colostrumson, respectively. The administration was carried out once a day for 47 successive days after 3 days of adaptive feeding, and organ index, white blood cell number, T-cell population, the contents of SOD and GSH-Px in blood, and feed/gain ratio of mice were determined at the end of the administration. Results indicated that selenium-enriched G3, bovine colostrumson and selenium-enriched bovine colostrumson could increase the utilization efficiency of diet, enhance the activities of SOD and GSH-Px in blood, and improve mouse immune function. Compared with the control group, the selenium-enriched bovine colostrumson exhibited best improved immune at the high dosage.

selenium；bovine colostrumson；Rhodopseudomonas palustris；cyclophosphamide；immunization

TQ929.3

A

1002-6630(2010)21-0373-05

2010-06-24

江蘇省科學技術廳高新技術項目(BG2005326)

楊啟銀(1951—)，男，副教授，主要從事微生物應用和微生物制劑的研究。E-mail：yangqiyin@163.com