HuR蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達及其意義

王曉娜 成麗

原發性卵巢惡性腫瘤是病死率最高的婦科惡性腫瘤。因其臨床癥狀隱匿，確診時多數患者已屬晚期，相當一部分患者在手術和化療后仍會出現疾病的進展或復發。因此，進一步明確卵巢癌發生、發展的分子生物學機制，尋找早期診斷及有效治療卵巢癌的方法成為廣大學者們研究的焦點。人抗原R(human antigen R，HuR)是人胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族中的一員，是一種RNA結合蛋白，能夠與許多編碼細胞調節蛋白、生長因子及其受體、炎性介質、誘導酶等基因的mRNA 3＇－非翻譯區結合，繼而增加這些mRNA的穩定性，提高蛋白質的表達水平［1］。近年來，國外對HuR在卵巢癌、乳腺癌、腦腫瘤等中研究較多［2－4］，并提出卵巢癌細胞質中HuR高表達與不良預后及淋巴結轉移相關［2］，但國內關于HuR在卵巢漿液性腫瘤中的表達情況研究尚少。本文對HuR蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達及其意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007至2009年在我院手術切除并經病理學檢查證實的62例新鮮組織標本。其中正常卵巢組織10例(正常組)，卵巢漿液性瘤組織標本20例(良性組)，卵巢漿液性癌組織標本32例(卵巢癌組)?；颊咝g前未經放射、化學及激素治療，所有組織標本均由兩名有經驗的病理科醫生確診。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本制作:組織經4%甲醛固定12 h，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm連續切片，用黏附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，將載玻片放入60℃溫箱中干燥。

1.2.2 免疫組化染色(SP法):切片經二甲苯脫蠟，再逐級經純乙醇及梯度乙醇直至蒸餾水水化。染色步驟嚴格按SP試劑盒說明書進行。鼠抗人COX-2單克隆抗體、免疫組化試劑盒及染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司，兔抗人HuR單克隆抗體(美國Santa Cruz產品)用抗原稀釋液稀釋為1∶160，抗原修復條件為:微波抗原熱修復。pH值6.0檸檬酸作為緩沖液。二氨基聯合苯胺(DAB)染色后，蘇木素復染，中性樹膠封固。磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)代替一抗作陰性對照，以已知陽性的人結腸癌組織為陽性對照。

1.3 結果判定 所有切片采用盲法由兩位病理科醫生獨立閱片，HuR陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞漿及細胞核中。每張切片于400倍光鏡下隨機選取4個視野，采用Meta Morph/DP10/BX41顯微圖像分析系統，對其中一個具有代表意義陽性結果的視野的棕黃色顆粒進行標記，以此標準自動檢測所有視野的陽性結果應用imagepro－plus(+)計算每張切片中HuR蛋白積分光密度值(IOD)，以參數積分光密度(IOD)代表蛋白顆粒密度。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，將灰度值取倒數，計量資料以ˉx±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組HuR瞬間表達細比較 HuR染色出現在細胞核及細胞漿中。其在正常卵巢、卵巢漿液性瘤及卵巢漿液性癌中的表達有胞漿染色逐漸增強、胞核染色逐漸減弱的趨勢。卵巢漿液性癌中HuR蛋白的IOD，顯著高于卵巢漿液性瘤和正常卵巢，差異有統計學意義(P＜0.05)。兩兩比較差異均有統計學意義(P ＜0.05)。見表 1。

表1 3組HuR蛋白表達比較

2.2 HuR蛋白與卵巢漿液性癌臨床病理特征的關系 HuR蛋白的表達與卵巢漿液性癌的淋巴結轉移有關(P＜0.05)。見表2。

表2 HuR蛋白與卵巢癌臨床病理特征的關系ˉx±s

3 討論

真核細胞內轉錄和翻譯過程發生于不同的細胞部位，使得遺傳信息從DNA流向蛋白質的過程中，可以在多點成功實現調控。mRNA水平的轉錄后調控是基因表達中的重要調控點，轉錄后基因的調控可以通過改變翻譯效率和mRNA穩定性實現［5］，涉及這種調節的序列大多群集于轉錄本的非翻譯區(untranslated regions，UTR)，包括5'UTR 和3'UTR。3'UTR 可以調節轉錄本的穩定性、定位和翻譯水平。位于許多基因的3'UTR的腺嘌呤和尿嘧啶的序列(AU-rich elements，AREs)，如AUUUA和AUUUUA序列，是調節mRNA更新的最常見的順式作用元件。研究表明，多種RNA結合蛋白可以與上述順式作用元件結合，從而調控mRNA的降解速率。HuR蛋白是最具有代表性的RNA結合蛋白之一，HuR基因位于人類第10號染色體短臂1區3帶第二亞帶，編碼的蛋白是胚胎致死異常視覺(ELAV)家族成員之一。正常情況下，HuR蛋白主要表達在細胞核，但在多種條件如低氧、放射性損傷和細胞因子等刺激下可從細胞核轉運到細胞漿，并改變RNA的空間結構從而抑制脫腺苷化、抑制mRNA募集至外切酶體(exosom)或阻斷可識別ARE的核酸內切酶的活性，繼而增強mRNA的穩定性［6］。

Denkert等［7］研究了83例原發性卵巢癌、16例卵巢交界性腫瘤、3例正常卵巢組織及9種卵巢癌細胞系(OVCAR-3，SKOV-3，Mdah2774，CAOV-3，ES-2，PA-1，OAW42，A27/80，EFO-27)中HuR蛋白的表達及在細胞內的分布。HuR mRNA和蛋白在所有細胞系中均有表達，免疫組化方法顯示HuR蛋白在腫瘤細胞核中陽性表達率為81%，在細胞漿中陽性表達率為45%，并發現細胞漿中HuR陽性率與患者的預后有關，表達高者預后差。本研究發現，在正常卵巢組織、卵巢漿液性瘤組織HuR蛋白相對含量與卵巢漿液性癌比較中差異有統計學意義(P＜0.05)，表明在卵巢漿液性癌的發生過程中有HuR表達增強，同時HuR蛋白的表達與卵巢漿液性癌的淋巴結轉移有關，這與Erkinheimo等［2］研究結果一致。因此檢測各組卵巢組織中HuR蛋白的表達，有助于診斷和鑒別診斷卵巢良、惡性腫瘤，可以作為間接判斷卵巢癌預后的指標之一。同時阻斷HuR與一些基因的mRNA 3＇－UTR的結合，可以預防某些腫瘤的發生。

1 Ross J.mRNA stability in mammalian cells.Microbiol Rev，1995，59:423-429.

2 Erkinheimo TL，Lassus H，Sivula A，et al.Cytoplasmic HuR expression correlates with poor outcome and with cyclooxygenase 2 expression in serous ovarian carcinoma.Cancer Res，2003，63:7591-7594.

3 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65:2157-2161.

4 Nabors LB，Gillesp ie GY，Harkins L，et al.HuR，a RNA stability factor，is expressed in malignant brain tumors and binds to adenine and uridine－rich elements within the 3＇untranslated regions of cytokine and angiogenic factor mRNAs.Cancer Res，2001，61:2154-2161.

5 Garneau NL，Wilusz J，Wilusz CJ.The highways and byways of mRNA decay.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:113-126.

6 Wang JG，Collinge M，Ramgolam V，et al.L FA －1 －dependent HuR nuclear export and cytokine mRNA stabilization in T cell activation.J Immunol，2006，176:2105-2113.

7 Denkert C，Weichert W，Pest S，et al.Overexpression of the embryonic －lethal abnormal vision－like protein HuRin ovarian carcinoma is a prognostic factor and is associated with increased cyclooxygenase－2 expression.Cancer Res，2004，64:189-195.