大蒜素對人宮頸癌Hela細胞增殖影響及其作用機制

張敏 郭亮

大蒜素(Allicin)是大蒜中主要生物活性成分的總稱，是從大蒜鱗莖中分離出的具有多種生物學活性的化合物。現代醫學研究證實大蒜素具有多種生物活性如(抗菌、消炎、提高機體免疫力和抗腫瘤的作用［1－3］)。體外研究顯示，大蒜素可以通過誘導癌細胞生成活性氧(ROS)，上調 Bax和 Bak，激活Caspase-3等方式促進其凋亡［4，5］。本研究以體外培養的人宮頸腺癌Hela細胞為材料，探討大蒜素對宮頸癌細胞增殖的影響并研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細胞由河北醫科大學病理教研室提供;大蒜素(二烯丙基代磺酸酯)購于河北醫科大學第二臨床醫院藥房;四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Ho33342、碘化丙啶(PI)為美國Sigma產品;DMEM、新生牛血清為美國Gibco產品;Bcl-2、Bax單克隆抗體購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:人宮頸癌Hela細胞用含10%小牛血清的DMEM培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下靜置培養。選擇對數生長期細胞進行分組實驗。

1.2.2 MTT法檢測大蒜素對細胞增殖的影響:細胞以5×104/ml的密度接種于96孔培養板中，培養48 h后，每孔加入不同濃度的大蒜素各 100 μl，濃度分別為 1、5、10、20 μg/ml，對照組加入含10%FBS的培養基，分別培養12、24、48 h后，分別向每孔加入20μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入 DMSO 100μl，振蕩5 min;酶標儀檢測(吸光度為550 nm)。每時間濃度組設3個復孔，實驗重復3次。所得OD值根據公式計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(1－OD實驗組/OD正常組)×100%，以空白組OD值調零。

1.2.3 大蒜素誘導宮頸癌:Hela細胞凋亡最適濃度篩選以上各實驗組加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342(濃度10μg/ml)37℃溫育20 min，再加入PI(濃度50μg/ml)，熒光顯微鏡觀察并記錄圖象。

1.2.4 細胞形態學觀察:10μg/ml大蒜素分別作用0～24 h，每隔2 h顯微鏡觀察1次，隨機選取視野記錄圖象。

1.2.5 流式細胞儀檢測:大蒜素對細胞周期的影響:細胞以5×104/ml－1接種于 25 cm2培養皿中，培養 48 h 后，加入10 μg/ml大蒜素，分別培養 12、24 h，棄培養液，加入 0.25% 胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心8 min收集細胞。細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，500μl PBS懸浮細胞，加入含10μg/ml的 RNase的 PI，4℃染色30 min。經200目濾網過濾后，上機檢測。實驗結果采用Modifit軟件進行細胞周期各期的百分率分析。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測大蒜素對Bcl-2和Bax的影響:細胞以5×104/ml接種于25 cm2培養中，培養48 h后，加入10μg/ml大蒜素分別培養12和24 h，收集細胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。經PBS再次清洗后，不同時間組細胞分別加入兔抗人Bcl-2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC標記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。陰性對照PBS代替一抗。PBS清洗3次后上流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.0統計件，計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素對宮頸癌Hela細胞活性的影響 MTT結果顯示1～10μg/ml大蒜素均能抑制Hela細胞的增殖 ，呈時間-劑量依賴性關系;20μg/ml大蒜素細胞毒性作用明顯，作用12 h，細胞抑制率為74.71%，作用24 h以后細胞幾乎全部死亡。見表1。

表1 大蒜素對Hela細胞增殖的抑制作用n=6，%，ˉx±s

2.2 大蒜素誘導宮頸癌 Hela細胞凋亡最適濃度的篩選Ho33342和PI染色結果提示，各濃度組中，10μg/ml大蒜素對Hela細胞誘導凋亡作用最明顯;20μg/ml大蒜素主要表現為細胞毒性作用。因此，本實驗選取10μg/ml作為最適誘導濃度來探討其作用機制。

2.3 細胞形態學觀察正常條件下Hela細胞呈梭形或多角形，傳代培養48 h，細胞貼壁生長，有聚團現象;10μg/ml大蒜素作用6 h，細胞開始出現形態學改變，緊貼瓶壁的細胞邊界模糊，部分細胞縮起，分裂相減少;大蒜素作用12 h開始有凋亡小體出現;大蒜素作用24 h，大部分細胞回縮變圓，凋亡小體明顯，部分細胞懸浮于培養基中，細胞碎片增多。

2.4 大蒜素對細胞周期影響流式細胞儀檢測結果顯示，10μg/ml大蒜素作用12 h，Hela細胞凋亡率為 16.73%;作用24 h細胞凋亡率為24.03%。細胞周期均發生了明顯的變化，主要表現為G0/G1期細胞減少，G2/M期細胞增加，而S期細胞無明顯變化。

2.5 流式細胞儀檢測Bcl-2和Bax表達結果顯示，10μg/ml大蒜素作用12和24 h，可降低癌基因蛋白 Bcl-2表達(P＜0.01)，而促進 Bax表達 (P ＜0.01)。見表2。

表2 10μg/ml大蒜素誘導后不同時間Hela細胞Bcl-2和Bax表達ˉx±s

3 討論

本研究采用的大蒜素主要含三硫二丙烯，選擇人宮頸癌Hela細胞進行抑制增殖和誘導凋亡的研究，并初步探討了其作用機制。

細胞周期在腫瘤細胞的生長調控中具有重要作用，通過改變細胞周期來阻止腫瘤細胞的增殖已受到人們關注［6－8］。本研究發現，大蒜素作用后G1期Hela細胞明顯減少，G2/M期相對增多。其原因是大蒜素抑制G2/M期，使多數細胞不能通過M期向G1期的轉變，導致G1期細胞減少，使大量細胞停滯在M期，無法完成正常的有絲分裂，提示大蒜素對Hela細胞有周期特異性抑制作用;大蒜素對Hela細胞M期有阻滯作用，對臨床應用大蒜素防治宮頸癌，尤其與周期特異性化療藥物輔助應用治療宮頸癌具有重要的理論意義。Bcl-2家族在細胞凋亡中起著重要的作用，其家族成員包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等，促凋亡蛋白Bax、Bbad等。Bcl-2和Bax分別可以同源二聚體形式存在，二者之間可以形成異源二聚體。Bax的表達增多時，Bax-Bax的同源二聚體便誘導細胞凋亡;而Bcl-2的表達增多時，Bax和Bcl-2形成更為穩定的異源二聚體來抑制細胞凋亡。Bcl-2/Bax的比率可以調節細胞凋亡的速率［9］。本實驗證明經大蒜素處理的Hela細胞，Bax表達升高而Bcl-2水平明顯降低。提示大蒜素可通過降低Bcl-2/Bax的比率誘導Hela細胞凋亡。

1 Xiao D，Lew KL，Kim YA，et al.Diallyl trisulfide suppresses growth of PC-3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak induction.Clin Cancer Res，2006，12:6836-6843.

2 Li N，Guo R，Li W，et al.A proteomic investigation into a human gastric cancer cell line BGC823 treated with diallyl trisulfide.Carcinogenesis，2006，27:1222-1231.

3 Zhou Z，Tau HL，Xu BX，et al.Microarray analysis of altered gene expression in diallyl trisulfide-treated HepG2 cells.Pharmacol Rep，2005，57:818-823.

4 王惠蘭，張賀玲，袁芳，等.大蒜素單獨及與順鉑聯合對人宮頸癌Hela細胞生長的影響.實用婦產科，2004，11:349-310.

5 王惠蘭，劉影，張曉茗，等.大蒜素與順鉑單獨及聯合應用對宮頸癌裸鼠移植瘤生長的影響.中華婦產科雜志，2006，41:566-567.

6 Nagata S.Apoptosis by death factor.Cell，1997，88:355-365.

7 Cohen GM.Caspases:the executioners of apoptosis.Biochem J，1997，326:1-16.

8 Alhasan SA，Ensley JF，Sarkar FH.Genistein elicits pleiotropic molecular effects on head and neck cancer cells.Clin Cancer Res，2001，7:4174-4181.

9 Ina K，Itoh J，Fukushima K，et al.Resistance of Crohn’s desease Tcells to multiple apoptotic signals is associated with a bcl-2/Bax mucosal imbalance.J Immunol，1999，163:1081-1090.