聚合酶鏈反應對酶聯免疫吸附試驗HBsAg陰性樣本中病毒核酸的檢測

房景霞 劉宇思 孫紹秋 李玉梅 房輝

乙型肝炎是HBV感染引起的全球性疾病，而我國是乙型肝炎的高度流行區。據調查統計，在我國人群(＞3歲)中HB-sAg攜帶率為9.09%，HBV流行率高達60%以上［1］。發病例數約為50萬［2］，乙型肝炎的主要傳播途徑是臨床輸血傳播，我國各級采供血機構對乙型肝炎的篩查檢測為酶聯免疫檢測，但由于酶聯免疫吸附法(ELLSA)檢測“窗口期”的問題，標本檢測漏檢在所難免。我站自2008年9月至2009年1月，對無償獻血者血液樣本HBsAg ELISA檢測陰性的合格樣本(共計26 109份)行PCR檢測，對PCR檢測HBV DNA陽性的血液做報廢處理，并對這種獻血者跟蹤驗證，每兩周采血做HBV兩對半免疫檢測。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我站無償獻血者HBsAg ELISA檢查合格血液標本(共計26 109份)，分離血漿備用。DP1000核酸提取儀(上海科華實驗系統有限公司)，ABI7300熒光PCR擴增儀(上海科華)。試劑乙型肝炎熒光PCR試劑盒(上海科華生物有限公司，批號:20080328)。

1.2 方法

1.2.1 核酸篩查的樣本準備和匯集:采用Pooling-8方式，分別取所選定的8份血漿各150μl至1.5 ml離心管中振蕩混勻，加入40μl濃縮劑，再加入50μl促沉劑，混勻后4℃離心1 h(26 000 r/min)，棄去離心管內上層液體，剩余約160μl標本，振蕩混勻，低速離心數秒后用于核酸提取。

1.2.2 核酸提取:從每個離心管中吸取100μl待測匯集標本，加入去抑制劑磁珠混合溶液20μl，再加入130μl裂解液，采用核酸提取儀，根據儀器提示，依次加入洗滌液A、B、C及洗脫液，分離提取HBV DNA模板。

1.2.3 PCR擴增檢測:在裝有已配制好的PCR反應液的反應管中分別加入15μl已處理好的標本。然后將PCR反應管放入ABI7300熒光PCR擴增儀進行擴增檢測。PCR反應程序:通過預變性:95℃，2 min;變性:95℃，10 s;退火:55℃，20 s;延伸:72℃，20 s循環檢測。

1.3 結果判定 測定CT值≥50，并且內標CT＜45的標本為陰性標本，測定CT值在40～50的標本為灰區標本，建議復測或隨訪，測定CT值＜40的標本為HBV DNA陽性標本，須進行拆分。

1.4 陽性混合樣本的拆分 混合樣本陽性者均應進行拆分，找到各個樣本并分別進行單獨的核酸檢測，以確定陽性樣本的真正來源。并對HBV DNA陽性獻血者血液做報廢處理。

1.5 隨訪 所有HBsAg陰性，HBV DNA陽性的樣本都進行隨訪，并做HBV兩對半免疫檢測，再次采血應用不同于二次篩查的試劑進行HBsAg ELISA檢測，以便查找ELISA檢測與核酸檢測結果不一致的原因。

2 結果

2.1 PCR篩查結果 26 109份HBsAg陰性無償獻血標本，PCR檢測結果為陰性26 107份，陽性2份，ELISA漏檢率為7/10萬。

2.2 對2份PCR陽性獻血者血樣做HBV兩對半免疫檢測結果 見表1。

表1 2份PCR陽性標本乙肝兩對半檢測結果

2.3 2名PCR陽性獻血者追蹤隨訪結果 見表2。

表2 2名PCR陽性獻血者HBsAg追蹤隨訪結果

3 討論

HBV隱匿性感染常見于血清中僅有抗-HBc陽性的人群，表現為HBsAg表達水平低或不表達，而在血清或肝組織中能檢測到的HBV DNA，也多為病毒滴度很低。參照文獻［3］本次實驗結果26 109份HBsAg陰性的合格樣本中共檢出HBV DNA陽性血樣2例，檢出率為7/10萬。對該2名獻血者進行乙肝兩對半追蹤檢測，其中一名獻血者抗-HBc陽性，另一名獻血者檢測為陰性，后進行2～12周HBsAg檢測，1名獻血者轉陽，另1名雖然未轉陽，卻并不能排除HBV感染，可能是因為HBsAg的表達水平低于檢測的最低限度。可見血清學檢測HBsAg陰性并不能完全排除HBV感染。基于目前檢測HBsAg的ELISA試劑靈敏度不夠，難以檢出HBsAg呈低水平的人群的這種狀況，人們開始探討使用核酸檢測技術，核酸檢測技術可以顯著縮短血液感染病毒的檢測“窗口期”，降低經輸血途徑傳播病毒的風險。能提前20 d篩查出HBsAg陰性、HBV DNA陽性獻血者，因此核酸檢測技術比ELISA更靈敏，盡管從理論上并不能完全排除“窗口期”，但病毒核酸轉陽前的傳染性很低［4］，因此將核酸檢測技術用于血液篩查對提高輸血安全有著重要的意義。但PCR只能檢出復制狀態的病毒，難以表達非復制狀態的感染，因而用PCR方法檢測HBV DNA也不能完全代替血清標志物的檢測。

要加強對獻血者的篩選，首先應用ELISA法檢測HBsAg，去除HBsAg陽性血液，然后在此基礎上建議對HBsAg陰性血液加做PCR對HBV DNA核酸檢測，去除HBV DNA陽性血液，以確保輸血的安全。

1 梁曉峰，陳園生，王曉軍.中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學研究.中華流行病學雜志，2005，26:655-658.

2 王憬惺.乙型肝炎和輸血.中國輸血雜志，2006，19(增刊):16-18.

3 王良華，葉賢林，尚桂芳，等.免疫篩查陰性獻血者血樣病毒核酸檢測的研究.中國輸血雜志，2005，18:286-289.

4 季陽主編.輸血相關乙型肝炎及丙型肝炎的實驗室診斷.輸血與輸血技術.第1版.北京:人民衛生出版社，2003.218-220.