響應面法優化堿法提取林蛙卵團中粗多糖的工藝研究

劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

響應面法優化堿法提取林蛙卵團中粗多糖的工藝研究

劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

以林蛙卵團膠狀物為原料，采用堿法對粗多糖進行提取，在單因素試驗基礎上，采用響應面法對NaOH溶液濃度、料液比、提取溫度及提取時間進行優化。結果表明，堿法提取林蛙卵團膠狀物粗多糖的最佳工藝條件為NaOH溶液濃度1.2mol/L、料液比1:8(g/mL)、浸提溫度56℃、浸提時間73min。在此條件下林蛙卵團膠狀物粗多糖含量可達24.01mg/g。

林蛙；卵團膠狀物；多糖；響應面

中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)，又稱哈什蟆，屬兩棲綱無尾目蛙科蛙屬，為國家二級保護動物，主產于黑龍江、遼寧、吉林3省，尤以吉林省居多，是一種珍貴的兩棲類藥用經濟動物[1-2]。蛙類的卵子在通過輸卵管后，被輸卵管內分泌的物質逐層包裹，排出體外后，包裹卵子的物質呈膠狀，無色透明，俗稱卵團。這層卵透明帶是一種包圍在卵母細胞上的一種糖蛋白基質，由于其有著很強的異種抗原性，因此它可以引起抗生育效應[3-4]。

卵子的包裹物質，即卵團膠狀物質，成分復雜，不能完全確定其中的成分，但是從目前的研究可知：輸卵管直部分泌的物質有利于精子透過而與卵子結合，卷曲部分泌的物質多為含糖基的蛋白質及多糖類物質，為受精卵的發育提供必要的營養[5-10]。

多糖及其糖復合物不僅在生物體內具有重要的生物功能和較好的生物活性，而且在生命科學及醫藥領域上還具有巨大的應用價值。目前研究可知多糖具有增強機體免疫力，降低血糖、血脂，抗腫瘤，延緩衰老等作用[11-15]。本實驗主要對林蛙卵團膠狀物進行初步研究，對影響林蛙卵團膠狀物中粗多糖提取的幾個因素進行實驗分析，確定其最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林蛙卵團：通化市柳河縣。

苯酚、無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、冰醋酸、氫氧化鈉(均為國產分析純)。

1.2 儀器與設備

AUY220 EXP分析天平 北京賽多利斯有限公司；XMTD數顯水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；HPX-9162MBE數顯電熱培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LG10-2.4A高速離心機 北京醫用離心機廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 林蛙卵團膠狀物多糖的提取

精確稱取卵團膠狀物5g，按一定料液比加入NaOH溶液，水浴提取后，調節pH值到7左右，加入95%乙醇4℃過夜保存，離心，30℃烘干，即為林蛙卵團膠狀物粗多糖。

1.3.2 單因素試驗

對粗多糖提取影響較大的NaOH濃度、料液比、提取溫度及提取時間4個因素進行單因素試驗，分別討論其對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響。

1.3.3 響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Beknhen中心組合試驗設計原理，以粗多糖含量Y為響應值，設計四因素三水平響應面分析試驗，對林蛙卵團膠狀物粗多糖的提取條件進行優化，試驗因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。粗多糖含量計算式：

粗多糖含量/%=林蛙卵團膠狀物提取液中粗多糖質量/新鮮卵團膠狀物質量×100

2 結果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測定多糖含量[16]標準曲線

測得多糖含量標準曲線為：Y=0.0083X－0.0111，R2=0.9996。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 NaOH溶液濃度對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團膠狀物5g，按料液比1:8(g/mL)分別加入濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mol/L的NaOH溶液，55℃提取30min。調節pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積(此處為160mL)的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量。結果如圖1所示。

圖1 NaOH濃度對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

2.2.2 料液比對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團膠狀物5g，按NaOH濃度0.9mol/L，分別以料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 (g/mL)在55℃提取30min。調節pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量。結果如圖2所示。

圖2 料液比對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

從圖2可以看出，粗多糖含量在料液比1:4～1:8 (g/mL)的范圍內有顯著增加，而當料液比在1:8后就顯著下降，1:14～1:16(g/mL)極速下降。提取液的體積越大，溶劑與卵團膠狀物的接觸就越充分，在相同的時間內所得的粗多糖也就越多，當料液比達到1:10(g/mL)后溶出的粗多糖物質趨于飽和呈現下降趨勢。由于堿溶液的添

加量不斷增加直至達到過飽和狀態，因此粗多糖的含量并不是隨提取液體積增大而無限增加，相反，當達到一定極限值后反而會呈下降趨勢。

2.2.3 浸提溫度對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，料液比為1:8(g/mL)，溫度分別為15、25、35、45、55、65、75℃提取30min。調節pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量，結果如圖3所示。

圖3 浸提溫度對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖3可以看出，溫度在15～35℃范圍內，粗多糖含量顯著提高，溫度在35～55℃范圍內，粗多糖含量稍有降低，到65℃開始顯著下降。溫度的升高加快了卵團膠狀物的降解速度，在一定程度上有利于粗多糖的提取，但是溫度的升高也會引起蛋白質和多糖發生副反應，因此，當溫度在65℃以后，提取液顏色明顯變黃，并且散發很腥的難聞氣味，因此需要對溫度行嚴格控制。

2.立足于崗位，來合理安排。學校的工作面對的對象是學生這一有生命、有思維的群體，這也就表明了教師工作的特殊性。真正的人才，應該是在屬于自己的崗位上能夠做出一定的業績或突出貢獻的人。對于學習來說，崗位工作有教學崗位、管理崗位、后勤服務崗位等。所以，在學校人力資源管理工作中，必須要立足于教師的特點，結合學校的崗位需求，來對工作進行細致分工，充分尊重教師的工作能力和自身素質，給其一定的自我發展空間，這樣才能夠調動教師工作的積極性，優化工作效果，促進學校整體工作的有序推進。

2.2.4 浸提時間對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，添加比為1:8(g/mL)，時間分別為15、30、45、60、75、90、105min，在55℃提取。調節pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量，結果如圖4所示。

圖4 浸提時間對林蛙卵團膠狀物粗多糖含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖4可以看出，浸提時間在15～45min范圍內，粗多糖含量顯著提高，時間在45～75min范圍內，粗多糖含量趨于最高，到75min開始顯著下降。隨著浸提時間的提高，使卵團膠狀物有了更充分溶出的可能，從而在一定程度上提高了粗多糖的含量，但并不是隨著時間延長，粗多糖含量也呈正比的相應增高，而是達到一定極限值反而會下降。當時間達到75min后，提取液顏色明顯變黃，偏橘色并伴隨強烈的異味。

2.3 響應面分析試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果

對表2數據進行回歸擬合，得到林蛙卵團膠狀物多糖含量Y對X1、X2、X3、X4的回歸方程為：

表2 Box-Beknhen試驗設計與結果Table2 Design and results of Box-Beknhen experiments

表3 響應面試驗方差分析Table3 Variance analysis of response surface experiments

從表3可以看出，方程一次項中X4極顯著，X1、X3顯著，X2不顯著，方程二次項均為極顯著，X2與X3、X3和X4交互作用極顯著，X1與X3交互作用顯著，其余交互項均不顯著，表明試驗因子對響應值不是簡單的線性關系，而是呈二次拋物面關系。還可以看出影響林蛙卵團膠狀物中多糖得率的因素按影響的大小排序依次為浸提時間X4、浸提溫度X3、NaOH溶液的濃度X1、料液比X2，其中浸提時間對多糖得率的影響達到了極顯著水平(P＜0.01)。

表4 模型可信度分析Table4 Reliability analysis for the model

表4模型可信度分析表明，多元回歸關系顯著，R2和R2Adj分別達到96.08%、91.50%，說明方程擬合充分，回歸方程顯著，可用上述回歸方程描述個因子與響應值的關系。

2.3.2 響應面圖形分析

響應面的圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，圖5為運用SAS軟件分析得到的響應面圖和等高線圖，可以直接反應各因素對響應值的影響，找出最佳工藝參數以及各參數之間的相互作用，從響應面的最高的和等高線可以看出在所選的范圍內存在極值。將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖5所示。

如圖5a所示，在X1與X3交互作用等高線中，等高線密度沿X3軸方向略大于X1軸方向，說明X1和X3的交互作用中，X3對響應值峰值的影響大于X1、X3的變化可引起響應值較大幅度的變化。此外，等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，X1與X3、X4兩項的等高線呈圓形，可以知道它們間的相互作用對多糖提取率的影響很小，等高線扁平，證明因素間的相互影響較大。如圖5c所示，X3與X4交互作用等高線中，沿X3軸向等高線變化密集，而X4軸向等高線變化相對稀疏，說明X3對響應值峰值的影響比X4大，X3、X4兩因素的影響就很明顯。

圖5 響應面三維圖和對應的等高線Fig.5 Response surface and contour plots of response surface experiments

為求出最佳點的編碼值，對回歸方程取一階偏導，并解得：X1=0.1404、X2=0.3089、X3=1.1344、X4=0.9129，真實值為NaOH溶液濃度(X1)1.24mol/L、料液比(X2)1:7.5 (g/mL)、浸提溫度(X3)56.34℃、浸提時間(X4)73.7min，林蛙卵團膠狀物粗多糖含量理論值可達24.07mg/g，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數設定為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3) 56℃、浸提時間(X4)73min，經3次平行實驗，林蛙卵團膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g，可見，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬林蛙卵團膠狀物粗多糖含量。

3 結 論

使用堿液對林蛙卵團膠狀物中粗多糖的提取，采用響應面分析法優化提取工藝，依據回歸分析確定各因素對粗多糖含量的影響，經過優化后確定最佳工藝參數為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3)56℃、浸提時間(X4)73min，林蛙卵團膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g。

[1]李冬梅. 淺談中國林蛙長白山亞種及其相關產品[J]. 長春大學學報, 2006, 16(5): 74-76.

[2]李東風. 中國林蛙研究進展[J]. 遼寧師范大學學報, 2005, 28(1): 92-94.

[3]羅榮生, 趙劍興. 中華大蟾蜍輸卵管促受精因子的實驗分析[J]. 動物學報, 1995, 41(4): 404-406.

[4]陳章寶, 楊繼虞. 鯉魚卵透明帶糖蛋白分離純化研究[J]. 四川畜牧獸醫學院學報, 2001, 15(2): 17-22.

[5]BONNELL B S, REINHART D, CHANDLER D E. Xenopus laevis egg jelly coats consist of small diffusible proteins bound to a complex system of structurally stable networks composed of high-molecular-weight glycoconjugates[J]. Developmental Biology, 1996, 174(1): 32-42.

[6]仲娜, 郝林華, 王小如. 糖蛋白藥物研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2005 (12): 1400-1403.

[7]HEDRICK J L, KATAGIRI C. Bufo japonicus and Xenopus laevis laevis egg jellies contain structurally related antigens and cortical granule lectin ligands[J]. J Exp Zool, 1988, 245(1): 78-85.

[8]陳筠, 孟運蓮. 輸卵管特殊蛋白質的性質及其對女性生殖的影響[J].國外醫學: 計劃生育分冊, 2005, 24(5): 222-225.

[9]KATAGIRI C. Role of oviducal secretion in mediating gamete fusion in anuran amphibians[J]. Zool Sci, 1987, 4: 1-14.

[10]周柔麗. 哺乳動物凝集素及其生物學作用[J]. 生命的化學, 1995(1): 12-15.

[11]劉俊, 張燕平, 戴志遠, 等. 三角帆蚌多糖的提取及其抗氧化功能研究[J]. 食品科技, 2008, 33(12): 40-44.

[12]李英華, 韓冠英, 郭斌, 等. 鯊魚軟骨多糖對血脂的影響[J]. 遼寧中醫雜志, 2006, 33(6): 760-761.

[13]欒潔, 沈先榮, 蔣定文, 等. 鯊魚軟骨粘多糖對雄性小鼠免疫及生殖器官的輻射防護作用[J]. 中國輻射衛生, 2008, 17(2): 145-147.

[14]殷紅玲, 馬媛, 王璐, 等. 蝦夷扇貝內臟多糖的提取及清除羥基自由基作用的研究[J]. 水產科學, 2007, 26(5): 255-258.

[15]孫龍, 馮影. 蠶蛹多糖的堿液提取及免疫活性初步研究[J]. 林業科學研究, 2007, 20(6): 782-786.

[16]鄭必勝, 唐芳勇, 閆文娟, 等. 苯酚-硫酸法測定廣東蟲草菌絲體多糖含量的研究[J]. 農產品加工: 學刊, 2008, 8(8): 17-21.

Optimization of Alkaline Extraction Conditions for Crude Polysaccharides from Rana Egg Jelly by Response Surface Methodology

LIU Xiao-dan，ZHENG Ming-zhu，LIU Jing-sheng*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Rana egg jelly was used as the raw material to extract polysaccharides by an alkaline extraction method. Based on single factor experiments, NaOH concentration, material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time during extraction process were optimized by response surface methodology. Results exhibited the best extraction conditions were NaOH concentration of 1.2 mol/L, material-liquid ratio of 1: 8, extraction temperature of 56 ℃ and extraction time of 73 min. The extraction rate of crude polysaccharides can reach up to 24.01 mg/g.

Rana；egg jelly；polysaccharides；response surface methodology

Q538

A

1002-6630(2010)22-0096-05

2010-05-24

國家自然科學基金項目(30671536)

劉曉丹(1982—)，女，碩士研究生，主要從事水產品生物化學工程與功能性食品研究。E-mail：lxd820928@126.com

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品資源深加工與綜合利用研究。E-mail：liujs1007@vip.sina.com