虎杖中白藜蘆醇發酵和提取工藝

曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

虎杖中白藜蘆醇發酵和提取工藝

曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

目的：對虎杖中白藜蘆醇的發酵和提取工藝進行研究。方法：以漢中地區的虎杖為原料，通過正交試驗研究虎杖中白藜蘆醇自然發酵和提取條件。結果：最佳發酵條件為溫度45℃、料液比1:3、發酵時間48h、白藜蘆醇苷的轉化率為96.1%；自然發酵后最佳提取條件為98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h，白藜蘆醇的得率達1.912%；通過發酵和提取，虎杖中白藜蘆醇的提取率達90%。結論：本實驗可為虎杖中白藜蘆醇的發酵和提取提供一定參考。

虎杖；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷；發酵

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc)為蓼科多年生灌木狀草本植物，主要分布于我國長江以南各地和陜西、湖北及四川等地。虎杖含多種有效成分，主要包括蒽醌和芪類化合物，其中芪類化合物中的白藜蘆醇具有重要生物活性[1-3]。

白藜蘆醇(Res)化學名3,4,5-三羥基-二苯乙烯，分子式C14H12O3，熔點256～257℃。易溶于極性溶劑如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等[4-5]。在植物體內主要以白藜蘆醇苷(PDT)形式存在。

目前，虎杖中白藜蘆醇提取方法主要有兩類，一類是先提取白藜蘆醇苷，然后再利用專一性酶[6-7]將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，但在提取純化苷的過程中，原有的部分白藜蘆醇會丟失；另外一類方法是采用專一性酶[8]或是篩選專一性微生物[9]先將虎杖發酵使白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，然后再提取純化，雖然避免了虎杖中原有白藜蘆醇的損失，但操作繁瑣，成本較高。也有報道[10]利用虎杖中微生物產生的酶進行發酵，但對于發酵后的提取工藝報道各異。本實驗先將虎杖進行自然發酵，然后重點對提取工藝進行研究，通過優化發酵條件及提取工藝，為白藜蘆醇工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎杖(經陜西理工學院趙樺教授鑒定)產自秦嶺南坡中段漢中市留壩縣生產基地，先將虎杖切片，40℃干燥至質量恒定，用中藥粉碎機粉碎成細粉備用。經索氏提取，HPLC測定，虎杖中白藜蘆醇苷的含量3.70%，白藜蘆醇含量0.27%。

甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)；超純水 自制；白藜蘆醇苷對照品、白藜蘆醇對照品 中國生物制品研究所。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀 美國Waters公司；302型電熱鼓風干燥箱 山東濰坊醫藥集團股份有限公司醫療器械廠；FW-177型中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；AB204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；恒溫氣候箱、SHH421-420型恒溫水浴鍋 河北航天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

1.3.1.1 液相色譜條件

參考周建軍等[11-12]的檢測方法：色譜柱Symmertry-C18(3.9mm×150mm)，流動相乙腈-水(19.5:80.5)，流速1.0mL/min，柱溫28℃，檢測波長303nm，進樣量10μL，保留時間14min。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精確稱量白藜蘆醇苷4.0mg和白藜蘆醇3.0mg，分別置于100mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，再定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(白藜蘆醇苷質量濃度為40μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為30μg/mL)。

將儲備液配成5個不同質量濃度的混合液作為對照品溶液：1)白藜蘆醇苷質量濃度為4.00μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為27.00μg/mL的對照品溶液；2)白藜蘆醇苷質量濃度為8.00μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為21.00μg/mL的對照品溶液；3)白藜蘆醇苷質量濃度為12.0μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為15.00μg/mL的對照品溶液；4)白藜蘆醇苷質量濃度為16.00μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為9.00μg/mL的對照品溶液；5)白藜蘆醇苷質量濃度為20.00μg/mL，白藜蘆醇質量濃度為3.00μg/mL的對照品溶液。

1.3.1.3 標準曲線的建立

將5個不同質量濃度的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇對照品混合液依次分別進樣10μL，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標、以質量濃度(X)為橫坐標，用直線回歸方程的方法建立標準曲線，白藜蘆醇苷的直線方程為：Y=34983X+3570(r2=0.99991)，其質量濃度在4.00～20.00 μg/mL范圍內，線性關系良好；白藜蘆醇的直線方程為：Y=57938X+19801(r2=0.99994)，其質量濃度在3.00～27.00μg/mL范圍內，線性關系良好。

1.3.1.4 供試品溶液的制備

精確稱取虎杖粉末10.00g，按照一定的料液比加水，在恒溫培養箱中按照設定的溫度發酵，然后將發酵物按比例加入溶劑，回流提取3次，合并3次濾液，精確吸取濾液1mL，用甲醇定容到10mL，用0.45μm樣品過濾器過濾，待測。

1.3.1.5 含量測定

樣品溶液在與標準曲線相同的色譜條件下進樣，重復3次，根據標準曲線計算出樣品中白藜蘆醇苷及白藜蘆醇的含量，樣品色譜圖見圖1。

圖1 樣品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the sample

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 發酵條件的選擇

根據瞿衛林[13]的報道和曹庸[14]的專利，選擇發酵時間、溫度、料液比為考察因素，設計正交試驗進行發酵條件的選擇，并根據最優條件進行驗證性實驗。因素水平見表1。

表1 發酵條件正交試驗因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

1.3.2.2 提取條件的選擇

按最佳發酵條件進行發酵后，選擇甲醇體積分數、料液比、提取次數和提取時間作為考察因素，進行正交試驗，選擇最佳提取條件，并根據最佳提取條件進行驗證性實驗。因素水平見表2。

表2 提取條件正交試驗因素水平Table2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

2 結果與分析

2.1 發酵條件正交試驗

發酵條件正交試驗結果和方差分析見表3、4。

表3 發酵條件正交試驗設計及結果Table3 Design and results orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

從發酵正交試驗結果和極差分析看出，各因素的影響順序為發酵時間＞溫度＞料液比，通過對白藜蘆醇發酵條件的選擇以及經濟效益的綜合考慮，可以得出白藜蘆醇發酵的最佳條件：料液比1:3、溫度45℃、發酵時間48h。

表4 發酵條件正交試驗結果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

方差分析表明：發酵時間對白藜蘆醇含量的影響極顯著(F＞F(0.01))，發酵溫度對白藜蘆醇含量的影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而料液影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.2 發酵條件驗證性實驗

根據發酵正交試驗最佳工藝，進行驗證性實驗(n=3)，結果見表5。

表5 發酵條件驗證性實驗結果Table5 Results of confirmatory experiments for optimizing fermentation conditions

表5結果表明，經過發酵白藜蘆醇苷的轉化率達96.1%[(3.683－0.143)/3.683]，表明虎杖中絕大部分白藜蘆醇苷已轉化為白藜蘆醇。

2.3 提取條件正交試驗結果

提取條件正交試驗結果和方差分析見表6、7。

表6 提取條件正交試驗設計及結果Table6 Design and results orthogonal experiment for optimizing extraction conditions

表7 提取條件正交試驗結果方差分析Table7 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

從提取條件正交試驗結果和極差分析看出，各因素的影響順序為甲醇體積分數＞提取次數＞料液比＞提取時間，得出虎杖發酵后白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1 h。

方差分析表明，甲醇體積分數對發酵后提取影響極顯著(F＞F(0.01))，提取次數和料液比影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而提取時間影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.4 提取條件驗證性實驗

根據提取正交試驗確定的最佳工藝，精確稱取虎杖粉末10.00g，進行3次驗證性實驗，結果見表8。

表8 提取條件驗證性實驗結果Table8 Results of confirmatory experiments for optimizing extraction conditions

表8表明，虎杖發酵后白藜蘆醇提取的平均得率1.912%，RSD值0.53%。說明本實驗能將大部分白藜蘆醇提取出來，并且結果穩定。

3 討論與結論

采用干虎杖加水自然發酵，不需要專一性的酶和培養專一性的微生物，降低了成本、簡化了工藝。通過正交試驗得出白藜蘆醇的最佳發酵條件：溫度45℃、料液比1:3、發酵時間48h；白藜蘆醇苷的轉化率達96.1%，這與瞿衛林[13]等的報道基本一致。

通過正交試驗得出白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h。虎杖中白藜蘆醇的得率為1.912%，提取率達90%，結果遠遠高于向海艷[15]和董學偉[6]等的報道。本實驗結果為白藜蘆醇的工業化生產提供了參考依據。

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Fermentation and Extraction of Resveratrol from Polygonum cuspidatum

CAO Liang，ZHOU Jian-jun*，WEI Rui，LIU Yi-hong
(School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)

Objective: To explore the fermentation and extraction processing of resveratrol from Polygonum cuspidatum. Methods: Polygonum cuspidatum from Hanzhong area was used as the material to explore the optimal fermentation and extraction conditions of resveratrol by orthogonal experiments. Results: The optimal conditions for fermentation were fermentation temperature of 45 ℃, material-liquid ratio of 1:3, and fermentation time of 48 h. The conversion rate of polydatin was 96.1% under the optimal fermentation conditions. The optimal conditions for the extraction of resveratrol were 98% methanol as solvent, solid-liquid ratio of 1:6, extraction time of 1 h, and extraction repeat number of 3. The yield of resveratrol was 1.912% under the optimal extraction conditions. The extraction rate of resveratrol could reach up to 90% through optimal fermentation and extraction. Conclusion: These studies provide a theoretical reference for the fermentation and extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc；resveratrol；polydatin；fermentation

TQ214

A

1002-6630(2010)22-0207-04

2010-06-23

曹亮(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為植物資源開發與利用。E-mail：phas0614@tom.com

*通信作者：周建軍(1953—)，男，教授，碩士，研究方向為生物資源開發利用。E-mail：jjzhou01@163.com