響應曲面法優化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝

宋婉睿，聶少平，胡曉鵑，高麗英，邱奇琦，李 昌，謝明勇*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

響應曲面法優化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝

宋婉睿，聶少平，胡曉鵑，高麗英，邱奇琦，李 昌，謝明勇*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用響應曲面法對紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝進行優化。在單因素試驗基礎上，建立影響香豆雌酚粗提取物得率的3個主要因素即液料比、提取溫度和提取時間與提取率之間的數學模型。利用SAS V8.0軟件分析表明：在液料比27.28:1(mL/g)、提取溫度67.7℃和提取時間13.77h時，香豆雌酚粗提取物得率較高，最佳提取率為2.64‰，與預測值基本相符。

紫花苜蓿；香豆雌酚；提取；響應曲面法

香豆雌酚(coumestrol)，又名考邁斯托醇、擬雌內酯，是一種含雌激素活性的晶狀化合物，最初被提取于白三葉草中，因其結構與當時已發現的異黃酮類植物雌激素不同，而是一種香豆素衍生物，故被命名為香豆雌酚[1]。研究表明：香豆雌酚為苯并呋喃并香豆素，單一成分，是一種主要存在于紫花苜蓿等豆科植物的具有擬雌激素作用和抗雌激素作用的天然活性物質[2]。現代研究已證實植物雌激素對女性絕經綜合癥[3]、心血管疾病[4]、癌癥[5]、骨質疏松[6]及生殖系統[7]等都具有較好的調節作用，且其中的一些功能也已在香豆雌酚的研究中得到證實[8-10]，但由于其許多方面尚處于研究階段，還未廣泛地應用到制藥和保健品等領域。

近年來，對于香豆雌酚的研究已逐漸受到重視，但大多集中在香豆雌酚的檢測及生物活性方面[11-14]，有關香豆雌酚的提取卻很少提及。本實驗采用甲醇回流浸提的方法對紫花苜蓿中的香豆雌酚進行粗提取，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法(response surface methodology，RSM)[15-16]對溫度、時間、液料比3個主要影響香豆雌酚粗品提取率的因素進行優化，探索紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取的最佳工藝，為香豆雌酚的提取提供新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去脂的紫花苜蓿干粉：紫花苜蓿干草(浙江)粉碎過40目篩，索氏除脂后干燥備用。

香豆雌酚標準品(純度99%以上) Sigma公司；甲醇、石油醚(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠；TU-1990雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SHZIIIB循環水真空泵 上海亞榮生化有限公司；DFY-500粉碎機 溫嶺市大海藥材器械廠；索氏抽提器 上海精密儀器有限公司；DGG-9140B電熱鼓風干燥箱、D2G-6050真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香豆雌酚標準曲線的繪制

精密稱取香豆雌酚標準品5.5mg，用少量甲醇溶解后置于100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成55mg/L的標準品儲備液。精密量取標準品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成2.75、5.5、8.25、11、13.75、16.5mg/L的香豆雌酚甲醇溶液，于波長343nm處測定吸光度[1]，另取甲醇溶液作為空白對照。以香豆雌酚質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制香豆雌酚標準曲線。

1.3.2 樣品中香豆雌酚粗品的單因素提取及含量的測定

稱取去脂的紫花苜蓿干粉2.00g，放入250mL燒瓶中，按一定的液料比加100%甲醇溶液，在一定溫度下提取一定時間，冷卻，過濾。濾液于100mL容量瓶定容，精密吸取樣品液1mL，置10mL容量瓶中定容測定吸光度，按標準曲線計算紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的含量。

1.3.3 紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的計算

1.3.4 響應曲面試驗設計

表1 響應面因素水平編碼表Table1 Factors and levels of response surface experiments

在單因素試驗基礎上，選取3個主要影響紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的因素即液料比(mL/g)、提取溫度/℃以及提取時間/h，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計(表1)及分析方法對紫花苜蓿中香豆雌酚提取工藝進行優化[17]。

2 結果與分析

2.1 香豆雌酚標準曲線

香豆雌酚的標準曲線回歸方程為C=0.09533A＋0.00571，R2=0.9997，線性良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對香豆雌酚提取的影響

在提取時間3h、提取溫度50℃條件，研究7種不同液料比對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響，分別為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1 (mL/g)，結果見圖1。

圖1 液料比對香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

由圖1可知，液料比的變化對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的得率有較大的影響。隨著液料比的增加，香豆雌酚粗提取物的得率先增加后降低，在液料比為25:1時得率達到最高。此結果與多數酚類研究類似[17]。

2.2.2 提取溫度對香豆雌酚提取的影響

圖2 提取溫度對香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取時間3h條件下，設定30、40、50、60、65、70℃ 6個溫度，研究提取溫度對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響。結果如圖2所示，隨著溫度的提高紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加顯著，在65℃時達到最大，隨后得率有所下降，可能由于過度高溫破壞了香豆雌酚的結構。

2.2.3 提取時間對香豆雌酚提取的影響

圖3 提取時間對香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取溫度50℃條件，設定3、6、9、12、15、17、19h 7個提取時間，研究提取時間對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響。結果如圖3所示，隨著時間的增加紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加顯著，在12～17h之間呈現平穩，隨后得率有所下降，可能由于提取時間過長，香豆雌酚受到了破壞。

2.3 響應曲面試驗分析與優化

2.3.1 試驗結果與模型建立

表2 響應面分析試驗設計及結果Table2 Design and results of orthogonal experiments for the extraction of crude coumestrol from Alfalfa

試驗結果見表2，利用SAS V8.0統計軟件對數據進行回歸擬合，得到香豆雌酚粗提取物得率對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

2.3.2 方差分析

表3 回歸方程方差分析Table3 Variance analysis for regression equation

利用SAS Rsreg程序對表2數據進行回歸分析(表3、4)。結果表明，以紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率為響應值所建立的回歸模型具有高度的顯著性。方程一次項、二次項、交叉項和總回歸的影響都顯著，并且一次項中X1、X2極顯著，X3顯著，而二次項中X22極顯著，X1X2和X2X3次之，表明各因素對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響都不是簡單的線性關系。

表4 回歸方程偏回歸系數的估計值Table4 Estimated value of partial regression coefficients for regression equation

從表4可見，方程的決定系數為97.26%，R2Adj= 92.32%，由此可知，用上述回歸方程描述各因素與響應值即紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率之間的關系時，其因變量和自變量之間的線性關系顯著，其回歸方程的擬合程度和可信度均較高，能夠很好地對紫花苜蓿香豆雌酚粗提取物得率進行很好的預測。且由表4中P值可知，各因素影響程度從大到小為液固比、提取溫度和提取時間。

2.3.3 響應曲面分析

利用SAS軟件的Rsreg程序進行典型分析，得到各因素的最優值的代碼值X1=0.455219、X2=0.532936、X3=－0.617042，換算后得出相應的實際值為液料比27.28:1 (mL/g)、浸提溫度67.7℃、提取時間13.77h，此時紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率理論值Y=2.62‰。

圖4 液料比(X1)與提取溫度(X2)對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

圖5 液料比(X1)與提取時間(X3)對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

圖6 提取時間(X3)與提取溫度(X2)對紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

2.3.4 回歸模型的驗證實驗

采用上述優化條件進行3次平行實驗，檢測響應曲面法所得結果的可靠性，實際測得的紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的平均得率為2.64‰，實驗值與理論值的相對誤差為0.76%，證明應用響應曲面法優化紫花苜蓿中香豆雌酚提取工藝的可行性較高。

3 結 論

研究表明：采用響應曲面法優化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝，其香豆雌酚粗提取物的得率在液料比27.28:1(mL/g)、提取溫度67.7℃、提取時間13.77h時達到最大，此時紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率為2.64‰，與預測值2.62‰的相對誤差為0.76%。

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Optimal Extraction of Coumestrol from Alfalfa by Response Surface Methodology

SONG Wan-rui，NIE Shao-ping，HU Xiao-juan，GAO Li-ying，QIU Qi-qi，LI Chang，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The extraction processing of coumestrol from Alfalfa was optimized by response surface methodology (RSM). On the basis of single-factor experiments, a mathematical regression model was established for predicting between extraction rate of crude coumestrol and three critical extraction factors including material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time. The optimal extraction processing parameters were material-liquid ratio of 27.28:1 (mL/g), extraction temperature of 67.7 ℃ and extraction time of 13.77 h. Under these optimal conditions, the actual extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa was 2.64‰, which was well consistent with the predicted value. These results can provide a theoretical reference for the extraction of coumestrol from Alfalfa.

Alfalfa；coumestrol；extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0242-05

2010-06-28

南昌大學國際科技合作項目(2010DFA31780)

宋婉睿(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：ojecar2000@126.com

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學與分析、食品營養與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn