響應面法優(yōu)化無梗五加果多糖超聲波、微波法提取工藝研究

馮 穎，陳巧紅，孟憲軍，王建國

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866； 2.遼寧省質量技術監(jiān)督局，遼寧 沈陽 110003)

響應面法優(yōu)化無梗五加果多糖超聲波、微波法提取工藝研究

馮 穎1，陳巧紅1，孟憲軍1，王建國2

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866； 2.遼寧省質量技術監(jiān)督局，遼寧 沈陽 110003)

根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理采用響應面分析法，分別對無梗五加果多糖的超聲波提取工藝和微波提取工藝進行優(yōu)化。結果表明：超聲波法提取多糖的最佳工藝參數(shù)為料液比1:70(g/mL)、提取時間50min、提取功率175W、提取溫度為60℃，實際測得多糖得率為3.491%；微波法提取多糖的最佳工藝參數(shù)為料液比1:40 (g/mL)、提取時間80s、提取功率595W，實際測得多糖得率為3.482%，與模型預測值基本相符。

無梗五加；多糖；提取；響應面

無梗五加，又名短梗五加，為五加科五加屬植物。長期以來，在我國東北地區(qū)代替刺五加藥用[1-2]。2003年韓國學者文獻報道無梗五加果多糖具有抗腫瘤活性[3]，本課題組也曾研究報道無梗五加果多糖具有清除羥自由基、抗疲勞、抗缺氧、免疫調節(jié)的活性[4]。因此，開發(fā)利用無梗五加果多糖資源，優(yōu)化其提取工藝，對擴大其應用和工業(yè)化生產具有現(xiàn)實意義。響應面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可檢查一個或多個響應變量與一系列試驗變量之間的關系，確定試驗因素及其交互作用在工藝過程中對指標響應值的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系，在試驗設計與結果表述方面更加優(yōu)良[5-8]。近年來，科研工作者將響應面分析法應用于植物多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，提取參數(shù)更加精確，多糖提取率大大提高[9-13]。而目前尚未見有關于響應面法應用于無梗五加果多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化方面的研究報道。課題組在前期試驗[14-15]研究的基礎上，進一步采用響應面法對該多糖的超聲波法提取工藝和微波法提取工藝進行了優(yōu)化，旨在加速無梗五加果多糖在功能食品和藥品領域的應用步伐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無梗五加干果：人工栽培品種，由遼寧省丹東農業(yè)科學院提供。

無水乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、濃硫酸、苯酚均為分析純。

7200型可見分光光度計 尤尼柯(上海)有限公司；微波爐 Galanz公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司； SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學儀器有限公司；布氏漏斗、小型粉碎機、天平等。

1.2 無梗五加果多糖提取工藝流程

無梗五加干果→粉碎→微波(超聲波)提取→抽濾→濾液→醇沉過夜(乙醇體積分數(shù)達到75%)→離心→沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌→60℃烘干→粗多糖粉末

1.3 多糖測定方法及提取率的計算

取0.01g粗多糖粉末，以適量蒸餾水溶解并定容至100mL，取2mL采用苯酚硫酸法[9-10]測定多糖質量濃度，從而計算提取出的多糖質量，并計算提取率。

多糖測定的標準曲線：Y=9.0518X－0.0116[(Y為吸光度，X為多糖質量濃度/(mg/mL)]，R2=0.9916。

多糖提取率/%= 提取出的多糖質量/原料用量×100 (原料用量均為2g)

基于上述分析，已知信息節(jié)點集合可采用上述方法依次進行不等概率抽樣來確定。不完全信息下節(jié)點失效策略即為優(yōu)先失效集合中的節(jié)點和隨機失效集合中的節(jié)點。同時，為避免高重要度節(jié)點的重復入樣，上述不等概率抽樣為無放回的，即每完成一次抽樣后，重新計算ρi和χi再進行抽樣，直至獲取η×n個已知信息節(jié)點為止。

1.4 超聲波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計因素水平及編碼

在前期單因素試驗[9]的基礎上，選擇提取功率、提取溫度、提取時間以及料液比為自變量，根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理采用四因素三水平的響應面分析法，確定超聲波法提取無梗五加果多糖的最佳工藝參數(shù)。試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 超聲波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計因素水平及編碼Table1 Factors and levels of response surface methodology for ultrasonic extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

1.5 微波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計因素水平及編碼

在前期單因素試驗[10]基礎上，選擇提取功率、提取時間以及料液比為自變量，根據(jù)中心組合(B o x-Behnken)試驗設計原理采用三因素三水平響應面分析法，確定微波法提取無梗五加果多糖的最佳工藝參數(shù)。試驗設計因素水平及編碼見表2。

表2 微波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計因素水平及編碼Table2 Factors and levels of response surface methodology for microwave extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

2 結果與分析

2.1 超聲波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計及結果

表3 超聲波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計及結果Table3 Design and results of response surface methodology for ultrasonic extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

根據(jù)表3的結果，利用Minitab 15軟件對表 3中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。得到無梗五加果多糖提取率對編碼自變量的二次多項式回歸模型為：

表4 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table4 Significance test and variance analysis for the regression model of ultrasonic extraction

表4結果表明該模型回歸顯著。模型的R2=0.9863，說明模型與實際實驗擬合較好，自變量和響應值之間關系顯著。模型失擬項P=0.885，不顯著，表明該回歸模型對實驗結果擬合良好，實驗誤差小，因此，可用該回歸模型代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table5 Significance test for each item in the regression model of ultrasonic extraction

由表5可知，各因素對無梗五加果多糖得率的影響是X4＞X1＞X2＞X3，即料液比影響最大，其次是提取時間、提取溫度、提取功率。交互項除X2X4不顯著外(P＞0.05)，其余之間都顯著，即除提取溫度和料液比之間不存在顯著交互作用，其余之間都存在顯著的交互作用，各因素對無梗五加果實多糖得率的影響不是簡單的線性關系。

圖1 超聲波法提取無梗五加果多糖響應曲面分析Fig.1 Response surface analysis for ultrasonic extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

從圖1A可以看出，提取功率對多糖提取率的影響變化趨勢受料液比的交互作用的影響。當提取功率較小時，多糖提取率隨料液比的增加先快速增加到峰值后迅速減少，當提取功率較大時，多糖提取率隨料液比的增加而急劇增加。

從圖1B可以看出，提取時間對多糖提取率的影響變化趨勢受提取溫度的交互作用的影響。當提取時間較小時，多糖提取率隨提取溫度的增加而急劇增加，當提取時間較大時，多糖提取率隨提取溫度的增加變化不明顯。

從圖1C可以看出，提取時間對多糖提取率的影響變化趨勢受提取功率的交互作用的影響。當提取時間較小時，多糖提取率隨提取功率的增加而急劇增加，當提取時間較大時，多糖提取率隨提取功率的增加而下降。

從圖1D可以看出，提取時間對多糖提取率的影響變化趨勢受料液比的交互作用的影響。當提取時間較小時，多糖提取率隨料液比的增加減小，當提取時間較大時，多糖提取率隨料液比的增加而急劇增加。

從圖1E可以看出，提取溫度對多糖提取率的影響變化趨勢受提取功率的交互作用的影響。當提取溫度較低時，多糖提取率隨提取功率的增加而急劇增加，當提取溫度較高時，多糖提取率隨提取功率的增加降低。

2.3 超聲波法提取無梗五加果多糖響應面試驗模型的驗證

由回歸模型得到的無梗五加果多糖提取的最佳工藝條件為料液比1:70(g/mL)、提取時間50min、提取功率175W、提取溫度60℃，多糖提取的理論值達到3.695%。在此工藝條件下實際提取無梗五加果多糖，測定多糖提取率為3.491%，與理論最大值接近，說明回歸模型可以較好地反映出無梗五加果多糖提取的最佳條件。

2.4 微波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計及結果

表6 微波法提取無梗五加果多糖響應面試驗設計及結果Table6 Design and results of response surface methodology for microwave extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

表7 回歸模型方差分析Table7 Significance test and variance analysis for the regression model of microwave extraction

表7結果表明該模型回歸顯著。模型的R2=0.9780，說明通過二次回歸得到的多糖提取率的模型與實際實驗擬合較好，自變量和響應值之間關系顯著。模型失擬項P=0.981，不顯著，表明該模型對實驗結果擬合良好,實驗誤差小，因此，可用該回歸模型代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

表8 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table8 Significance test for each item in the regression model of microwave extraction

由表8可知，各因素對多糖提取率的影響是X3＞X1＞X2，即料液比對多糖提取率的影響最大，其次是提取時間，最后是提取功率。交互項X1X2、X1X3、X2X3顯著(P＜0.05)，表明提取時間、提取功率和料液比之間存在顯著交互作用，各因素對多糖得率的影響不是簡單的線性關系。各因素擬合后，選擇對響應值顯著的各項，得到無梗五加果實多糖得率對編碼自變量的二次多項式回歸方程為：Y=3.0606＋0.2270X1－0.6820X3＋0.6392X12＋0.4379X22－0.5697X1X2－0.3710X1X3－0.5146X2X3。

2.5 微波法提取無梗五加果多糖響應曲面直觀分析

圖2 微波法提取無梗五加果多糖響應曲面分析Fig.2 Response surface analysis for microwave extraction of polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits

從圖2A可以看出，提取功率對多糖提取率的影響變化趨勢受料液比的交互作用的影響。當提取功率較小時，多糖提取率隨料液比的增加變化不明顯，當提取功率較大時，多糖提取率隨料液比的增加而急劇減小。

從圖2B可以看出，提取時間對多糖提取率的影響變化趨勢受料液比的交互作用的影響。當提取時間較小時，多糖提取率隨料液比的增加變化不明顯，當提取時間較大時，多糖提取率隨料液比的增加而急劇減小。

從圖2C可以看出，提取時間對多糖提取率的影響變化趨勢受提取功率的交互作用的影響。當提取時間較小時，多糖提取率隨料液比的增加而急劇增加，當提取時間較大時，多糖提取率隨提取功率的增加下降。

2.6 微波法提取無梗五加果多糖響應面試驗模型的驗證

回歸模型預測的微波法提取多糖的最佳工藝條件為料液比1:40(g/mL)、提取時間80s、提取功率595W，多糖提取的理論值達到3.700%。實際測得提取率3.482%，與理論最大值接近，偏差較小，說明回歸模型可以較好的反映出無梗五加果多糖提取的最佳條件，從而也說明了響應面法對無梗五加果多糖提取條件參數(shù)優(yōu)化的可行性。

3 結 論

采用響應面分析法優(yōu)化無梗五加果多糖的超聲波法提取工藝及微波法提取工藝的最佳工藝參數(shù)分別為料液比1:70 (g/mL)、提取時間50min、提取功率175W、提取溫度為60℃，實際測得多糖得率為3.491%；料液比1:40(g/mL)、提取時間80s、提取功率595W，實際測得多糖得率為3.482%，與模型預測值基本相符。

[1]高鳳蘭, 孫振方, 哈永年, 等. 無梗五加原植物及其生態(tài)分布[J]. 中國中醫(yī)藥科技, 1997, 4(2): 106.

[2]淳于家龍, 郭麗娜, 張長順. 無梗五加化學成分與藥理活性的研究進展[J]. 中國藥業(yè), 2002, 11(2): 73-74.

[3]LEE SANG H, LEE YEON S, JUNG SANG H, et al. Antitumor and immunostimulating activities of Acanthopanax sessiliflorus fruits[J]. Natural Product Sciences, 2003, 9(2): 112-116.

[4]馮穎, 孟憲軍, 王建國, 等. 無梗五加果多糖組成及生物活性研究[J].食品科學, 2008, 29(4): 378-380.

[5]MYERS W R. Encycloedia of biopharmaceutical statistics[M]. New York: Marcel Dekker, 2003: 858-869.

[6]陳魁. 試驗設計與分析[M]. 北京: 清華大學出版社, 1996: 94-180.

[7]孟憲軍, 李冬男, 汪艷群, 等. 響應曲面法優(yōu)化五味子多糖的提取工藝[J]. 食品科學, 2010, 31(4): 111-115.

[8]HOU Xujie, CHEN Wei. Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 72(1): 67-74.

[9]YANG Bao, ZHAO Mouming, SHI J, et al. Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp[J]. Food Chemistry, 2008, 106: 685-690.

[10]ZHONG Kui, WANG Qiang. Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2010(80): 19-25.

[11]CHEN Xiao ping, WANG Xiang , LI Shuibing, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80: 944-948.

[12]WANG Yongjiang, CHEN Zhong, MAO Jianwei, et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of Poria cocos polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 77: 713-717.

[13]CHEN Yiyong, GU Xiaohong, HUANG Shengquan, et al. Optimization of ultrasonic/microwave assisted extraction (UMAE) of polysaccharides from Inonotus obliquus and evaluation of its anti-tumor activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 6: 429-435.

[14]孟憲軍, 田豐. 短梗五加果實多糖超聲波提取條件的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā), 2009, 30(2): 8-11.

[15]孟憲軍, 田豐. 短梗五加果實多糖微波輔助提取技術的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 310-313.

Optimization of Microwave and Ultrasonic Extraction of Polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus Fruits by Response Surface Methodology

FENG Ying1，CHEN Qiao-hong1，MENG Xian-jun1，WANG Jian-guo2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. Liaoning Bureau of Quality and Technical Supervision, Shenyang 110003, China)

The response surface methodology based on Box-Behnken design principle was used to optimize processing parameters of ultrasonic and microwave extraction for polysaccharides from Acanthopanax sessiliflorus fruits. Results showed that the optimal processing conditions of ultrasonic extraction were material-liquid ratio of 1:70 (g/mL), ultrasonic power of 175 W, extraction temperature of 60 ℃ and extraction time of 50 min. The optimal processing conditions of microwave extraction were material-liquid ratio of 1:40 (g/mL), microwave power of 595 W and extraction time of 80 s. The yields of polysaccharides were up to 3.491% and 3.482% under the optimal ultrasonic and microwave extraction conditions, respectively, which was consistent with the predicted results.

Acanthopanax sessiliflorus；polysaccharide；extraction；response surface methodology

O629.12

A

1002-6630(2010)22-0268-05

2010-06-30

遼寧省博士科研啟動基金項目(20091068)

馮穎(1975—)，女，副教授，博士，研究方向為天然產物與功能食品。E-mail：fywjg@sina.com