奶酪及乳清中β-內酰胺酶的檢測

劉曉川，喻東威，趙 源，劉志楠，薛志清，李 梅

(內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 011500)

奶酪及乳清中β-內酰胺酶的檢測

劉曉川，喻東威，趙 源，劉志楠，薛志清，李 梅

(內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 011500)

為探討原奶中β-內酰胺酶在制作奶酪過程中的去向，向無抗無酶的原奶中添加β-內酰胺酶，使其終水平為50U/mL，按照工藝制作原生奶酪，用E50法和杯碟法檢測奶酪和乳清中的β-內酰胺酶。結果顯示，奶酪中β-內酰胺酶檢測結果為陰性，乳清中β-內酰胺酶檢測結果為陽性，β-內酰胺酶在奶酪制作中主要殘留在乳清中。

奶酪；乳清；β-內酰胺酶；E50法；杯碟法

不法分子向原奶中添加β-內酰胺酶[1-7]可以掩蓋原奶抗生素殘留的檢測[8-10]，使不合格的原奶充當合格原奶從而進入乳制品的生產環節。β-內酰胺酶作為國家禁止的添加物，現行的檢測方法主要有直接法和間接法[11]。本實驗擬采用間接法(E50法、杯碟法)[12-13]對β-內酰胺酶在制作奶酪工藝中的去向進行探討，根據實驗結果分析β-內酰胺酶是否會隨奶酪工藝殘留在原生奶酪中，從而明確奶酪產品檢測β-內酰胺酶是否可行。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

原奶、新西蘭復原乳、β-內酰胺酶(酶活300萬U/mL) 中國藥品生物制品檢定所；青霉素鈉 華北制藥廠；E50試劑盒 上海千慕公司；溴甲酚紫葡萄糖半固體微孔板(未包被嗜熱脂肪芽孢桿菌)(參照GB/T 4789.27—2008《食品衛生微生物學檢驗：鮮乳中抗生素殘留檢驗》附錄A5配制后，加入無菌的微孔板，待凝固后即可使用)；抗生素檢測試劑盒(商品名：Twinsensor)北京優尼塞斯公司；藤黃微球菌標準菌株 CMCC(B) 28001 國家醫學菌種保藏管理中心。

HV-110高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；MMM生化培養箱 德國Friocell公司；VS-1300L-U潔凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；MS3旋渦混合儀 德國IKA公司；W20M-2E恒溫水浴箱 美國Shellab公司；E50試劑孵育器、Twinsensor試劑孵育器。

1.2 方法

1.2.1 原奶抗生素和β-內酰胺酶檢測

用Twinsensor檢測原奶的抗生素和β-內酰胺酶，合格后用于制作原生奶酪。

1.2.2 奶酪制作工藝流程

合格原奶(未添加β-內酰胺酶和添加β-內酰胺酶)→巴氏滅菌(75℃、15s)→冷卻→加發酵劑、CaCl2、凝乳酶→凝乳→切割→沉降→升溫攪拌→保溫攪拌→排乳清→堆積→加鹽→壓榨→原生奶酪

1.2.3 巴氏滅菌對β-內酰胺酶的影響

向原奶中添加β-內酰胺酶使其終水平為3U/mL，將原奶進行巴氏滅菌(75℃、15s)，用Twinsensor檢測β-內酰胺酶。

1.2.4 80℃加熱處理對β-內酰胺酶的影響

向原奶添加β-內酰胺酶使其終水平為3U/mL，將原奶在80℃水浴中加熱0、1、2min，用Twinsensor檢測β-內酰胺酶。

1.2.5 奶酪中β-內酰胺酶檢測

分別稱取原生奶酪(由原奶和添加β-內酰胺酶的原奶制作)20g于研缽中，加入40g海砂研磨至奶酪和海砂均勻混合，然后加入20mL蒸餾水繼續研磨至均勻的糊狀，移入50mL離心管中3000×g離心10min，將上清液分別移入兩個潔凈的容器中并調節pH值到6.4～6.7，待用。

取適量的奶酪(原奶制作)上清液分別在80℃水浴中加熱0、1、2min，各吸取50μL加入到溴甲酚紫葡萄糖半固體微孔中，置于37℃孵育器中培養2h50min(時間同E50培養時間)，觀察結果。

分別取適量的奶酪(由原奶和添加β-內酰胺酶的原奶制作)上清液置于80℃水浴中加熱1min滅活殘留菌體，用E50法檢測β-內酰胺酶。同時取適量奶酪(原奶制作)上清液，添加β-內酰胺酶使其終水平為2U/mL，置于80℃水浴中加熱1min滅活殘留菌體，用E50法檢測β-內酰胺酶。

分別取適量奶酪(由原奶和添加β-內酰胺酶的原奶制作)上清液用杯碟法檢測β-內酰胺酶。同時取適量奶酪(原奶制作)上清液，添加β-內酰胺酶使其終水平為1U/mL，用杯碟法檢測β-內酰胺酶。

1.2.6 乳清中β-內酰胺酶檢測

將乳清(原奶制作奶酪時收集和添加β-內酰胺酶的原奶制作奶酪時收集)的pH值調節到6.4～6.7，待用。

取適量的乳清(添加β-內酰胺酶的原奶)、10倍稀釋的乳清、17倍稀釋的乳清置于80℃水浴中加熱1min滅活殘留菌體，用E50法檢測β-內酰胺酶。

取適量的乳清(添加β-內酰胺酶的原奶)、10倍稀釋的乳清、17倍稀釋的乳清用杯碟法檢測β-內酰胺酶。同時取適量乳清(原奶)添加β-內酰胺酶使其終水平為1U/mL，用杯碟法檢測β-內酰胺酶。

2 結果與分析

2.1 原奶抗生素和β-內酰胺酶檢測

圖1 原奶抗生素和β-內酰胺酶的檢測結果Fig.1 Antibiotics andβ-lactamase test results of raw milk

經檢測(圖1)原奶抗生素呈陰性、β-內酰胺酶呈陰性，原奶合格。

2.2 巴氏滅菌對β-內酰胺酶的影響

圖2 巴氏滅菌對β-內酰胺酶的影響Fig.2 Effect of pasteurization onβ-lactamase residual

由圖2可知，巴氏滅菌(75℃、15s)對β-內酰胺酶幾乎沒有產生影響。

2.380 ℃加熱處理對β-內酰胺酶的影響

圖3 80℃加熱對β-內酰胺酶的影響Fig.3 Effect of heat treatment at 80 ℃ onβ-lactamase residual

由圖3可知，80℃加熱1～2min對β-內酰胺酶幾乎沒有產生影響。

2.4 奶酪中β-內酰胺酶的檢測

2.4.180 ℃滅菌實驗

圖4 奶酪(原奶制作)上清液80℃滅菌實驗結果Fig.4 Sterilization results of cheese (raw milk) up liquid by heat treatment at 80 ℃

由圖4可知，未加熱的奶酪(原奶制作)上清液培養后產酸使pH指示劑變黃，加熱后樣品中制作奶酪時殘留的菌體被滅活，不產酸則pH指示劑不變色。80℃加熱1～2min可滅活奶酪中殘留的菌體。

2.4.2 E50法檢測

由圖5可知，復原乳抗生素和β-內酰胺酶為陰性，對照符合實驗要求。原生奶酪(原奶制作)β-內酰胺酶為陰性，原生奶酪(添加β-內酰胺酶的原奶制作)β-內酰胺酶為陰性，原生奶酪(原奶制作)+2U/mLβ-內酰胺酶為陽性。

圖5 奶酪E50法檢測結果Fig.5 Detection results of cheese by E50 method

2.4.3 杯碟法檢測

圖6 奶酪杯碟法檢測結果Fig.6 Detection results of cheese by Oxford cup method

圖6 的抑菌圈直徑差值測量及判定結果如表1所示。

表1 奶酪杯碟法實驗結果Table1 Diameter of inhibition zone and β-lactamase of cheese by Oxford cup method

2.5 乳清中β-內酰胺酶的檢測

2.5.1 E50法檢測

圖7 乳清E50法檢測結果Fig.7 Detection results of whey by E50 method

由圖7可知，復原乳抗生素和解抗酶為陰性，對照樣品符合實驗要求。乳清β-內酰胺酶檢測結果為陽性，10倍稀釋的乳清β-內酰胺酶檢測結果為陽性，17倍稀釋的乳清β-內酰胺酶檢測結果為陰性。

2.5.2 杯碟法檢測

圖8 乳清杯碟法檢測結果Fig.8 Detection results of whey by Oxford cup method

圖8 的抑菌圈直徑差值測量及判定結果如表2所示。

表2 杯碟法實驗結果(乳清)Table2 Diameter of inhibition zone andβ-lactamase of whey by Oxford cup method

3 結 論

添加2U/mLβ-內酰胺酶的奶酪上清液經E50法檢測β-內酰胺酶陽性，單純奶酪上清液經E50法檢測β-內酰胺酶陰性。添加1U/mLβ-內酰胺酶的奶酪上清液經杯碟法檢測β-內酰胺酶陽性，單純奶酪上清液經杯碟法檢測β-內酰胺酶陰性。

β-內酰胺酶是水溶性蛋白質，在制作奶酪時不會

與酪蛋白一起變性沉淀，而會留在乳清液中，按工藝流程一起排出，用E50法和杯碟法檢測，乳清和10倍稀釋的乳清均為陽性，杯碟法檢測中乳清兩杯(A杯、B杯)抑菌圈平均直徑相差較大，由此得知β-內酰胺酶主要殘留在乳清中。奶酪經壓榨后含水量很低，故β-內酰胺酶殘留量亦很小，添加50U/mL的β-內酰胺酶用目前的E50法和杯碟法均無法檢出，回歸到實際生產中，在β-內酰胺酶酶殘留量很小的情況下，目前的兩種方法均無法檢出。

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Detection and Analysis of β-Lactamase in Cheese and Whey

LIU Xiao-chuan，YU Dong-wei，ZHAO Yuan，LIU Zhi-nan，XUE Zhi-qing，LI Mei
(Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group) Co. Ltd., Hohhot 011500, China)

To explore the destination of the β-lactamases of raw milk in the process of cheese, antibiotics and β-lactamasefree raw milk was mixed with β-lactamases to a final concentration of 50 U/mL. Then the raw milk was processed to cheese according to the general procedure, and β-lactamase in the cheese and whey was determined by using E50 method and Oxford cup method. The result of β-lactamase is negative in the cheese and positive in the whey. So β-lactamase is mainly left in whey in the processing of cheese.

cheese；whey；β-lactamase；E50 method；Oxford cup method

TS252.7

A

1002-6630(2010)22-0336-04

2009-10-09

劉曉川(1982—)，男，工程師，碩士，研究方向為乳及制品生物學。E-mail：xiaochuan54613@163.com