毛細管電泳法對乳及乳制品中真蛋白的測定

丁曉靜，楊媛媛，李 蕓，趙 珊，王 志

(1.北京市疾病預防控制中心，北京 100013；2.首都醫科大學公共衛生與家庭醫學學院，北京 100069；3.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001)

毛細管電泳法對乳及乳制品中真蛋白的測定

丁曉靜1,2，楊媛媛1,3，李 蕓1,2，趙 珊1，王 志3

(1.北京市疾病預防控制中心，北京 100013；2.首都醫科大學公共衛生與家庭醫學學院，北京 100069；3.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001)

利用毛細管電泳法對市售乳清蛋白粉、采自當地奶牛場的牛初乳及原料奶、同一品牌不同階段或同一階段內不同廠家、不同國別的嬰兒配方奶粉、不同保質期的液態奶、不同國別的超高溫滅菌(UHT)奶和酸奶、國產復原乳中α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白A (β-LgA)及β-乳球蛋白B (β-LgB)的質量分數進行測定。結果表明：α-Lac、β-LgA及β-LgB的質量分數在乳清蛋白粉、牛初乳及原料奶中依次降低。液態奶中上述3種蛋白的質量分數與保質期有關，一般保質期越久的產品，上述3種蛋白的質量分數越低。大多數酸奶中α-Lac的質量分數均高于UHT奶。嬰兒配方奶粉中α-Lac質量分數隨著階段數的增加而增加，而且同一階段內不同廠家不同國別配方奶粉中α-Lac質量分數差異也較大，并非進口奶粉中α-Lac質量分數均比國產奶粉高。

毛細管電泳；乳清蛋白粉；牛初乳；原料奶；嬰兒配方奶粉；超高溫滅菌奶；酸奶

乳及乳制品是人體獲取蛋白質的主要來源之一，蛋白含量的高低已成為乳品質量的指標之一[1]。為了生產優質的乳品，發達國家十分重視乳品基礎性研究，對乳品中蛋白檢測非常重視并在技術上具有優勢。我國雖已開展了相關工作，但相對薄弱且未形成系統，檢測技術主要是凱氏定氮法和比色法[2]，這兩種方法均是通過測定樣品中的氮元素質量分數，乘以系數6.38來推算出樣品中的總蛋白質量分數，但此法所測的氮元素有可能包括樣品中的非蛋白氮，近幾年發生的“大頭娃娃”、“三聚氰胺”毒奶粉事件正是由于這兩種方法

的局限性為不法分子摻加含氮有機物以提高蛋白質質量分數提供了可乘之機，嚴重侵害了消費者的利益，在很大程度上制約了我國乳業的良性發展。盡管新的國家標準能夠測定乳品中非蛋白氮質量分數[3]，但仍不能直觀地反映乳品中真蛋白的質量分數。因此，監測乳品中真蛋白質量分數變化，對生產過程中質量控制、提高產品檔次、增強國有產品競爭力具有重要意義。

乳及乳制品中蛋白主要分為酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白約占總蛋白的80%，乳清蛋白約占15%。因為乳清蛋白是牛奶的主要成分之一，其含量的高低經常被用于評價乳品質量[4]。乳清蛋白是酪蛋白沉淀后清液中含有的蛋白[5]，主要由對熱不穩定的α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白(Ig)和牛血清白蛋白(BSA)組成。對熱穩定性依下列順序Ig＜BSA＜β-Lg＜α-Lac而增加[6-7]，即α-Lac對熱較為穩定。其中α-Lac約占乳蛋白的3%、β-Lg約占9%、Ig占2%、BSA占1%，β-Lg又由β-LgA及β-LgB組成[8]。上述蛋白構成了乳中的“真蛋白”。目前世界上越來越多的國家如美國、法國、澳大利亞等開始采用真蛋白含量作為原料乳收購的計價因子，然而，由于該法依據的原理仍然是凱氏定氮法，因而可能會因不法分子摻加大豆水解蛋白等植物蛋白而失靈。國外又開發了快速檢測真蛋白的方法，主要有紅外光譜分析法、傅里葉轉換紅外線法及染料染色法等方法，但僅有一部分的乳品真蛋白快速檢測方法被AOAC認可[1]。

毛細管電泳法(CE)因分離效率高，非常適合擴散系數小的蛋白質分析，已成功地用于保健食品中免疫球蛋白G的檢測[9-10]，乳及乳制品成分分析和真蛋白定量測定[11-15]。十二烷基硫酸鈉(SDS)-CE法已被作為國際標準(ISO、IDF)方法用于檢測奶粉中是否摻入大豆或花生蛋白[16]。我國尚未用CE法對乳及乳制品中的α-Lac、β-LgA及β-LgB開展系統研究。因此，本研究利用CE技術分離測定乳及乳制品中α-Lac、β-LgA及β-LgB 3種蛋白[17]，通過乳清蛋白中質量分數較高的這3種蛋白質量分數變化的趨勢，以期探索一種能夠有效監測、控制乳及乳制品的產品質量，保護消費者的利益及健康的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑及電泳條件請詳見文獻[17]。乳清蛋白粉、嬰兒配方奶粉、液態奶樣品及酸奶樣品均購于當地超市，牛初乳及原料奶均采自當地奶牛場。所有樣品均平行測定兩次。

1.2 儀器與設備

Beckman P/ACE 5000型毛細管電泳儀(配有紫外檢測器和P/ACE工作站) 美國Beckman公司；F-33 pH/mV型酸度計 北京屹源電子儀器科技公司；Universal 32型離心機 德國Hettich公司；Millipore Milli-Elix/RiOs型超純水器 美國Millipore公司；旋渦混合器 法國Gilson公司。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白粉的測定

稱取0.5g樣品置于50mL塑料離心管中，加入20mL 0.05mol/L HAc溶液(pH2.98)，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液直接進樣分析，所測樣品通過加標來定性，以校正峰面積法定量(表1)。因為在CE分析中，遷移時間較長的組分，其峰面積將相應展寬而導致峰面積增加，為消除這一影響，一般將每個峰的峰面積除以各自的遷移時間即校正峰面積進行定量[18]。

表1 乳清蛋白粉中α-Lac、β-LgA、β-LgB測定結果Table1 Results ofα-Lac, β-LgA and β-LgB in whey protein powder

2.2 牛初乳、原料奶的測定

圖1 牛初乳和原料奶的毛細管電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of bovine colostrum and raw milk

牛初乳是母牛生產后7d內產下的乳汁，具有極高

的營養價值。原料奶亦稱生鮮奶，為初乳期過后采集的常奶。準確移取2mL牛初乳或原料奶于50mL塑料離心管中，加入18mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進樣。結果見表2，電泳圖如圖1所示。

表2 牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA和β-LgB的測定結果Table2 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in bovine colostrum and raw milk

由表2可以看出，牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB質量分數均較高，一般情況下，β-乳球蛋白(β-Lg)的兩個遺傳變異體β-LgA和β-LgB總是同時存在，但在本實驗所測的1#初乳樣品中卻不含β-LgB，5#初乳樣品中不含β-LgA，這兩種極端情況與Kim等[19]報道的情況相一致，極端情況與β-LgA及β-LgB的等位基因有關。

2.3 不同保質期牛奶樣品的測定

表3 不同保質期牛奶樣品中α-Lac、β-LgA和β-LgB的測定結果Table3 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in milk of different shelf-life

從市場選取國產同一品牌、不同保質期的牛奶樣品進行測定。準確移取2mL牛奶樣品于15mL塑料離心管中，加入3mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進樣。結果見表3，電泳圖見圖2。保質期為3d和7d的產品為巴氏殺菌奶，3種蛋白的質量分數最高，蛋白被破壞程度小，而保質期為30、50、180d和240d的產品均為UHT奶，3種蛋白的質量分數顯著下降，β-LgA和β-LgB已經無法檢出，其中α-Lac質量分數差別不大，保質期為30d的牛奶的電泳圖不同于保質期為240d的牛奶的電泳圖，從圖2中很容易辨別是巴氏殺菌奶還是超高溫滅菌奶。

圖2 不同保質期的牛奶樣品及6#樣品加100mg/L 3種蛋白混標電泳圖Fig.2 Electrophoregrams of milk of different shelf-life and sample 6#spiked with 100 mg/L of three mixed protein standards

2.4 不同國別、不同廠家UHT奶的測定

表4 進口、國產UHT奶中α-Lac的測定Table4 Content ofα-Lac in UHT milk from imported and domestic products

從當地超市購買不同國家生產的UHT奶，為便于比較，對每一國家生產的UHT奶均采集同一廠家但不

同口味的產品，按2.3節方法處理樣品進行測定。結果如表4所示，同一廠家但不同口味的產品中α-Lac質量分數存在一定差異；無論是進口還是國產UHT奶，其中α-Lac質量分數有一定差異，可能與生產工藝或原料奶來源有關。

2.5 復原乳樣品的測定

由于當前市場上標識有復原乳的樣品較少，將采自當地超市國內某廠家的5個標識為復原乳、保質期均為15個月的樣品，按2.3節方法處理樣品進行測定。由于復原乳至少經過二次受熱，其中α-Lac的質量分數顯著下降，僅在盒裝的復原乳中檢測到α-Lac質量分數為13.6mg/100g，其余4種罐裝復原乳樣品中α-Lac質量分數低于定量限，無法準確定量。這兩種包裝的產品中α-Lac質量分數差異或許與加工工藝有關。另外，復原乳中α-Lac的質量分數顯著低于國產UHT奶，或許通過這種途徑很容易判斷所謂的鮮奶是否為復原乳。

2.6 酸奶樣品的測定

準確稱取2g酸奶樣品于15mL塑料離心管中，加入3mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進樣。分別測定不同國家、不同廠家的酸奶樣品，檢測發現酸奶樣品中不含易致敏的β-lgA及β-lgB，僅含α-Lac，這也證明對牛奶過敏的人喝酸奶則不易過敏。測定結果見表5。

表5 不同國別、不同廠家酸奶樣品中α-Lac測定Table5 Content ofα-Lac in yogurt from different countries and plants

由表5可知，酸奶樣品中的α-Lac質量分數比UHT牛奶樣品中的質量分數普遍偏高，進口樣品中α-Lac的質量分數大多高于國產樣品，西班牙樣品的保質期達270d，其中α-Lac質量分數比國產奶制品保質時間只有20d左右的樣品質量分數還要高，澳大利亞的5#樣品中質量分數高達97mg/100g，與原料奶中的質量分數相差不大，說明在產品加工過程中蛋白損失少。但并非所有的酸奶樣品α-Lac質量分數均高，如國產中的16#樣品，其質量分數低于方法的定量限，無法準確定量。2.7不同階段配方奶粉中α-Lac的測定

母乳中含有豐富的α-Lac且不含β-LgA及β-LgB，Lucla等[20]采用反相高效液相色譜法測定不同人群不同哺乳期的母乳中α-Lac質量濃度，其測定值在160～825mg/ 100mL范圍內，因此，α-Lac經常被添加到嬰兒配方奶粉中以提高奶粉的母乳化程度，同時除去其中嬰幼兒不耐受的β-lgA及β-lgB。此外還添加了利于嬰兒健康成長的營養成分，這些添加的組分干擾β-LgA及β-LgB的準確測定，因而用文獻[17]方法只能測定奶粉中α-Lac的質量分數。準確稱取0.5g樣品于15mL塑料離心管中，加入5mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進樣。從市場上采購的1#、2#和3#三個品牌的Ⅰ段(嬰兒配方奶粉)、Ⅱ段(較大嬰兒配方奶粉)和Ⅲ段(幼兒配方奶粉)奶粉中α-Lac質量分數值見表6，電泳圖見圖3～5。

表6 不同階段奶粉中α-Lac的測定Table6 Content ofα-Lac in infant formula of different age stages

圖3 1#樣品3個階段及Ⅲ段加標電泳圖Fig.3 Electrophoregrams of three age stages of sample 1#and age stage III spiked with three mixed proteins

圖4 2#樣品3個階段及Ⅲ段加標電泳圖Fig.4 Electrophoregrams of three age stages of sample 2#and age stage III spiked with three mixed proteins

圖5 3#樣品3個階段電泳圖Fig.5 Electrophoregrams of three age stages of sample 3#

表6結果表明：同一階段內的不同樣品中α-Lac的質量分數不同，存在較大差異。不同階段的配方奶粉具有不同的α-Lac質量分數，而且隨著階段數的增加，α-Lac質量分數呈上升趨勢，這種質量分數變化應該與嬰幼兒的成長需要相關。

2.8 同一階段內國產與進口奶粉的比較

表7 同一階段國產與進口奶粉中α-Lac測定Table7 Content ofα-Lac in infant formula from domestic and imported products with the same age stage

表7表示同一階段內，不同國別、不同廠家的奶粉中α-Lac質量分數。通過同一階段內國產奶粉與進口奶粉的比較，發現并不是所有進口奶粉的α-Lac質量分數都比國產奶粉高，如進口奶粉中的6#、13#、19#等樣品，其α-Lac質量分數只有21、43、19mg/100g，此值遠遠低于其他奶粉的質量分數水平，而某些國產奶粉的α-Lac質量分數與進口奶粉相當，甚至高于進口奶粉，如國產奶粉的3#、4#、9#、14#等樣品，其α-Lac質量分數分別為167、212、234、310mg/100g。

3 結 論

無論是牛初乳，還是原料奶，其中的α-Lac、β-LgA及β-LgB三種蛋白的質量分數均高于市售巴氏殺菌奶和UHT奶，證明巴氏或UHT殺菌加工過程中，能降低原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB三種蛋白的質量分數。α-Lac的質量分數依原料奶、巴氏乳及UHT奶的順序而依次降低，與涂層毛細管的實驗結果相一致[21]。隨著CE技術的不斷完善和發展，因其較適合蛋白分析且綠色、環保，在乳及乳制品中真蛋白分析中將會發揮越來越重要的作用。

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Use of Capillary Electrophoresis for Determination of Genuine Proteins in Milk and Milk Products

DING Xiao-jing1,2，YANG Yuan-yuan1,3，LI Yun1,2，ZHAO Shan1，WANG Zhi3
(1. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China；2. School of Public Health and Family Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China；3. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

The contents of theα-lactalbumin (α-Lac), β-lactoglobulin A (β-LgA) and β-lactoglobulin B (β-LgB) were determined by capillary electrophoresis in whey protein powder, bovine colostrum and raw milk from the local farm, infant formula of the same brand but for different age stages or of the same age stages from different plants and countries, liquid milk with different shelf-life, ultra-high temperature (UHT) milk and yogurt from different countries and domestic reconstituted milk. The contents of the above three proteins decreased in the order of whey protein powder, bovine colostrum and raw milk, and were negatively related to the shelf-life of milk and milk products. The content of α-Lac in most of the yogurts were higher than that in UHT milk. The contents of the α-Lac in infant formula increased with the age stage. Infant formula with the same age stages of different brands and countries had significant differences in the contents of α-Lac. The contents of α-Lac in imported formula were not always higher than those from domestic ones. The results provide a valuable asset for the analysis of true proteins in milk and milk products.

capillary electrophoresis；whey protein powder；bovine colostrum；raw milk；infant formula；ultrahigh temperature (UHT) milk；yogurt

O657.8

A

1002-6630(2010)22-0361-06

2010-03-05

北京市“十百千”衛生人才培養項目

丁曉靜(1968—)，女，副主任技師，博士，研究方向為食品衛生理化檢驗。E-mail：dingxiaojing@gmail.com