競爭ELISA法對牛乳β-酪蛋白的檢測

宋宏新，潘 潔，柏紅梅，薛海燕

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021)

競爭ELISA法對牛乳β-酪蛋白的檢測

宋宏新，潘 潔，柏紅梅，薛海燕

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021)

通過確定包被抗體最佳稀釋度(anti-β-CN IgY 1:160)、封閉液及封閉時間(含1%明膠的PBST，封閉1h)、酶標抗原(1:20)和待測脫脂牛乳樣品稀釋液(1:80)抗體作用時間(60min)、底物最佳反應時間(20min)、溫度(37℃)等對競爭ELISA效果有重要影響的因素，建立檢測牛乳β-酪蛋白的競爭ELISA法。經(jīng)敏感性實驗和重復性實驗證明本實驗建立的競爭ELISA法最低檢出量為5.1μg/mL，變異系數(shù)(CV)小于5%，可以開發(fā)應用于牛乳及其制品的蛋白質(zhì)品質(zhì)快速檢測。

競爭ELISA；β-酪蛋白；雞卵黃抗體(IgY)

有效的檢測技術是保證乳品質(zhì)量安全的重要方面，目前的乳品摻假檢測技術主要針對摻假物一對一檢測[1-4]，主要有近紅外光譜法、高效液相色譜法、電泳法和免疫學方法等。光譜法、液相色譜法及電泳法具有準確快速、重復性好、適用于定量檢測等優(yōu)點，但由于其設備造價高，操作繁瑣的原因，難以滿足基層及現(xiàn)場快速篩查的要求。本實驗以牛乳β-酪蛋白為目標蛋白，建立的競爭ELISA檢測方法對牛乳固有酪蛋白進行檢測，免疫檢測法具有特異性強，操作簡單易行，尤其針對乳品中摻入其他雜蛋白的鑒別和原料奶酪蛋白質(zhì)量的快速檢測，在乳及乳制品質(zhì)量安全監(jiān)控方面有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞卵黃抗體(anti-β-CN IgY，效價為1:2048)和酶標牛乳β-酪蛋白抗原(β-CN-HRP，效價為1:320)分別參考文獻[5-7]制得；大豆蛋白粉(S)和明膠(G) 北京鼎國生物技術有限責任公司；牛乳β-酪蛋白(β-CN)、牛乳β-乳球蛋白(β-Lg)、酶標兔抗雞抗體IgG-HRP 美國Sigma公司。

ELISA采用辣根過氧化物顯色系統(tǒng)：1)包被緩沖液(CB)：0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液；2)洗滌液與稀釋液(PBST)：0.01mol/L pH7.4 PBS+0.5% Tween-20；3)封閉液(G)：含1%明膠的PBST；4)終止液：2mol/L H2SO4；5)底物溶液：2mL底物緩沖液(pH5.0磷酸檸檬酸緩沖液)+0.1mL TMB+6.4μL H2O2。

MK3型Thermo酶標儀 美國Thermo公司；酶標板(96孔聚苯乙烯板) 北京原平皓生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體的封閉

將抗體和牛乳β-乳球蛋白和大豆蛋白粉混合培養(yǎng)，封閉其中會和牛乳β-酪蛋白產(chǎn)生交叉反應的抗體成分。

1.2.2 競爭ELISA步驟

以合適質(zhì)量濃度的blocked anti-β-CN IgY包被酶標板(每孔100μL，4℃過夜)，以封閉液(每孔300μL，4℃封閉過夜)封閉；同時加入等量酶標抗原和抗原(系列濃度標準抗原或待測乳樣各50μL)，于水平軌跡搖床上室溫孵育2h，進行競爭反應。其中的洗板、顯色、測定操作同一般ELISA[8]。

2 結果與分析

2.1 抗體 IgY的交叉反應檢測與抗體修飾技術

雞卵黃抗體(anti-β-CN IgY)為多克隆抗體，是以標準牛乳β-酪蛋白作抗原免疫獲得雞卵黃，經(jīng)分離純化后得到的多克隆抗體。該多抗必須通過交叉反應對抗體的特異性進行評價。通過抗體修飾技術[9-10]，將抗體和牛乳β-乳球蛋白和大豆蛋白粉混合，于37℃培養(yǎng)2h，封閉其中會和牛乳β-酪蛋白產(chǎn)生交叉反應的抗體成分，可減少各批多克隆抗體間的變異程度，從而提高抗體的免疫反應特異性。步驟如下：1)用PBST將抗體質(zhì)量濃度稀釋至1mg/mL；2)牛乳β-乳球蛋白(5mg/mL)和大豆蛋白粉(4mg/mL)等體積混合后，再與步驟1)所得液體等體積混合，37℃孵育2h后，4℃隔夜放置得到修飾的抗體(blocked anti-β-CN IgY)，質(zhì)量濃度為2.75mg/mL。

圖1 兩種抗體與4種蛋白抗原的交叉反應Fig.1 Cross-actions of anti-β-CN IgY and blocked anti-β-CN IgY with four kinds of antigens

anti-β-CN IgY 和blocked anti-β-CN IgY 的交叉反應[11-14]通過間接ELISA檢測，分別將4種蛋白質(zhì)抗原：β-酪蛋白(β-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)、明膠(G)和大豆蛋白粉(S)以2n倍比稀釋后包被酶標板，兩種抗體(質(zhì)量濃度調(diào)整至100μg/mL)與包被的蛋白質(zhì)抗原反應，洗滌后加入酶標兔抗雞抗體IgG-HRP(1:2000)，孵育后加入底物溶液顯色，檢測A450nm值，結果見圖1。

由圖1a可知，anti-β-CN IgY與β-酪蛋白、β-乳球蛋白、大豆蛋白粉、明膠(蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在12.5～1.6μg/mL范圍內(nèi)，除明膠外其他3種蛋白A450nm均大于0.2)免疫反應后，A450nm值由大到小的順序為β-酪蛋白＞β-乳球蛋白＞大豆蛋白粉＞明膠。anti-β-CN IgY對β-乳球蛋白的親和力與對其相應蛋白質(zhì)抗原β-酪蛋白的親和力較為相近，對大豆蛋白粉的親和力稍弱，A450nm顯示存在一定交叉反應，而與明膠(A450nm＜0.2)基本沒有交叉反應。

由圖1b可知，通過所建立的競爭ELISA體系用blocked anti-CN IgY多克隆抗體分別與β-酪蛋白(β-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)、明膠(G)、大豆蛋白粉(S) (12.5μg/mL)進行交叉反應。結果表明blocked anti-β-CN IgY對β-酪蛋白的特異性明顯提高，對其他3種蛋白基本沒有交叉反應。本實驗建立的ELISA體系特異性良好，可以應用于進一步實驗。

2.2 競爭ELISA檢測體系的建立[15-16]

2.2.1 競爭ELISA程序

通過方陣法，設定A450nm≈1.0，確定blocked antiβ-CN IgY(稀釋起始質(zhì)量濃度為1mg/mL)的包被最佳濃度為1:160；酶標抗原最佳工作濃度β-CN-HRP為1:20。

2.2.2 競爭ELISA法的標準曲線

以最適抗體質(zhì)量濃度包被，加入酶標抗原(最適工作濃度的2倍)和系列濃度標準抗原(β-酪蛋白起始質(zhì)量濃度為400μg/mL，按2n稀釋)各50μL，搖床上室溫孵育2h，洗板4次后顯色測定繪制標準曲線，結果表明，當標準β-酪蛋白質(zhì)量濃度分別在6.25～400μg/mL時，IC50為348μg/mL，A450nm與β-酪蛋白的濃度呈良好的線性關系，可以用于β-酪蛋白在此質(zhì)量濃度區(qū)間的快速測定。

2.2.3 競爭ELISA方法的指標評價

2.2.3.1 敏感性實驗

根據(jù)已建立的競爭ELISA檢測方法，向脫脂牛乳中摻入不同梯度的明膠，應用實驗的最佳反應條件確定最低檢出量。所得數(shù)據(jù)結果見表1。

表1 競爭ELISA法測定脫脂乳品敏感性實驗平均值Table1 Sensibility assay of indirect-ELISA for skim milk

結果以P/N≤0.5判斷為陽性。經(jīng)3組平行重復實驗檢測混合樣品中牛乳成分的最低檢出量為3.5%即5.1μg/mL，接近國外采用哺乳動物抗血清免疫方法檢出量[17-18]，有關其他摻假蛋白的研究還有待深入。

2.2.3.2 穩(wěn)定性實驗

配制5種不同質(zhì)量濃度的β-酪蛋白標準溶液，每一質(zhì)量濃度平行測定5次，用競爭ELISA法測定吸光值，去除最大最小值，剩下3個值取平均，比較驗檢結果的重復性，測量結果見表2。

表2 競爭ELISA實驗的重復性Table2 Reproducibility assay of competitive-ELISA

從表2可以看出，板內(nèi)檢測陽性抗原的A450nm值的變異系數(shù)(CV)小于5%，回收率91%～97%，說明所建立的競爭ELISA檢測β-CN抗原具有良好的重復性。

2.3 牛乳樣品的檢測

2.3.1 牛乳樣品制備及稀釋度的確定

將鮮牛乳和脫脂牛乳(3000r/min離心20min)分別以2n倍比稀釋(稀釋度1:10)后與最佳工作濃度下的酶標抗原(β-CN-HRP)等體積混合，按100μL /孔加入已包被的酶標孔進行競爭反應，實驗發(fā)現(xiàn)鮮牛乳中的脂肪的存在對競爭ELISA影響較大，當牛乳的稀釋度從1:1增加到1:320時，A450nm值呈現(xiàn)無規(guī)則變化，陰性對照值一直低于1，因此無法取值。而鮮牛乳經(jīng)過脫脂后進行競爭ELISA檢測，A450nm隨脫脂牛乳稀釋度的增加而增加，當脫脂牛乳的稀釋度在1:80時陰性A450nm≈1.0，陽性A450nm值小于0.4，且P/N值相對較小。因此選擇脫脂牛乳的競爭稀釋度為1:80，或者可以不作稀釋。

2.3.2 牛乳樣品的測定

表3 乳品蛋白含量檢測結果Table3 Detection results of protein content in dairy products

由表3可知，以β-酪蛋白為檢測蛋白建立的競爭ELISA法測得樣品中β-酪蛋白質(zhì)量濃度，并通過一般牛乳成分中總蛋白/β-酪蛋白的比例系數(shù)2.8572，計算得到理論總蛋白的質(zhì)量濃度，然后與通過考馬斯亮藍法測定的實際總蛋白質(zhì)量濃度相比較，相對誤差在－0.84%～0.1%范圍內(nèi)，CV小于5%。該結果反映了本實驗所建立的ELISA體系測定牛乳蛋白質(zhì)量濃度的準確度和精密度都較高，可以實現(xiàn)ELISA檢測體系對牛乳質(zhì)量的定性定量監(jiān)測。錢博[19]研究發(fā)現(xiàn)采用考馬斯亮藍法與傳統(tǒng)的凱式定氮法測定乳中的真蛋白的結果沒有顯著性差異，因此本實驗選用考馬斯亮藍法以酪蛋白繪制標準曲線來測定乳樣品的實際蛋白質(zhì)量濃度。

3 結 論

本實驗確定抗體最佳包被質(zhì)量濃度，酶標抗原最佳工作質(zhì)量濃度，封閉液及封閉時間，抗體稀釋液及酶標抗原作用時間，底物最佳反應時間等對競爭ELISA檢測有影響的因素，利用blocked anti-β-CN IgY抗體，初步建立了牛乳及其乳制品中固有蛋白成分的競爭ELISA檢測方法。以脫脂牛乳的檢測程序為例，操作程序簡單，整個檢測過程僅需4h(不計包被時間)，可同時處理多個不同牛乳樣品及重復實驗，競爭ELISA體系的最大特點是實驗操作作簡單快速，能夠?qū)崿F(xiàn)牛乳及其乳制品的快速定量檢測，很有開發(fā)應用潛力。

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Detection of Bovine β-Casein by Competitive ELISA

SONG Hong-xin，PAN Jie，BAI Hong-mei，XUE Hai-yan
(Institute of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

In order to establish a competitive ELISA method for detecting β-casein of bovine milk, the factors to affect competitive-ELISA were investigated. The optimal conditions for competitive ELISA method were coated anti-β-CN IgY concentration of 1:160, 1% gelatin-PBST as the blocking solution and blocking time of 1 h. The working titers betweenβ-CNHRP and detection samples were 1:20 and 1:80, respectively. The reaction time of antibody and antigen was 1 h and the optimum enzymatic reaction time was 20 min. Detection results indicated that the detected limit was 3.5% with a variation coefficient (CV) of less than 5%. This method can be used for rapid and accurate detection ofβ-casein in bovine milk and dairy products.

competitive ELISA；β-casein；egg-yolk antibody

Q512

A

1002-6630(2010)22-0450-03

2010-07-20

陜西省科學技術廳農(nóng)業(yè)攻關項目(2009K02-09)；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目(09JC19)

宋宏新(1959—)，男，教授，碩士，主要從事生物化學與分子生物學、食品科學和免疫檢測研究。E-mail：hongxinsong@163.com