番茄果實中全反式番茄紅素的C30-HPLC外標法定量檢測

丁 靖，惠伯棣*，劉 源

(北京聯(lián)合大學應用文理學院，北京 100191)

番茄果實中全反式番茄紅素的C30-HPLC外標法定量檢測

丁 靖，惠伯棣*，劉 源

(北京聯(lián)合大學應用文理學院，北京 100191)

為建立一種在C30-HPLC上使用外標法對番茄紅素全反式異構體進行定量檢測的方法，采用色譜條件：固定相：YMC Carotenoid columu C30色譜柱(4.6mm×250mm，SOD-5μm，Waters)；流動相A：乙腈-甲醇(3:1，V/V)；流動相B：甲基叔丁基醚(MTBE)；流動相A與B中分別添加0.05%(V/V)的三乙胺；線性梯度洗脫：B在20min內由0增至80%，20～35min內B維持在80%；流速：1mL/min；色譜圖檢測波長470nm；進樣量：20μL；柱溫：室溫。結果表明：此方法的最小定量限為0.10μg/mL，在10～100μg/mL范圍內質量濃度與組分峰面積的線性回歸方程為y=212181x，R2=0.9738。相對標準偏差為4.04%。外標加樣回收率為97.34%(RSD為0.904%)。應用本方法可對番茄果實中的全反式番茄紅素進行定量分析。

全反式番茄紅素；定量分析；外標；C30-HPLC

番茄紅素(lycopene)是一種自然界中廣泛存在的類胡蘿卜素(carotenoid)，含有11個共軛及2個非共軛碳-碳雙鍵，主要存在于番茄、番石榴、西瓜等食物以及一些微生物中，已被證明有多種健康功能[1-2]。由于番茄紅素分子高度的不飽和結構，使其在天然的生物合成系統(tǒng)中存在多種幾何異構體，主要包括全反式異構體(All E-isomer)和5-、9-和13-等順式異構體(Z-isomer)。同時，番茄紅素在哺乳動物體內代謝時也存在多種幾何異構體[3]。不同的異構體具有不同的生物學功能。因此，無論在合成代謝、降解代謝和在食品中的應用研究中，番茄紅素幾何異構體的定性、定量檢測是一個迫切需要解決的問題。

自從C30固定相問世以來，番茄紅素幾何異構體在HPLC上的分離問題已經(jīng)解決。尤其是Sander等建立了乙腈-甲醇和甲基叔丁基醚(MTBE)的洗脫條件后，番茄紅素幾何異構體在C30柱上具有了良好的分離和穩(wěn)定的色

譜行為[4-8]。目前，除全反式異構體外，只有5Z-番茄紅素的定性已有報道[9]。換言之，目前番茄紅素的全反式異構體在C30柱上具備定量的可行性[10-11]。本項研究旨在發(fā)展一套應用外標法在C30-HPLC上對番茄紅素全反式異構體進行定量測定的方法，并嘗試將該方法應用于番茄果實為原料的番茄紅素源食品。這對番茄紅素的生物合成和體內代謝等研究具有很強的現(xiàn)實意義。

圖1 全反式番茄紅素的分子結構Fig.1 Molecular structure of all-trans-lycopene

1 材料與方法

1.1 番茄果實樣品

7、8月應季新鮮番茄果實購自各地超市與食品市場。

1.2 參比樣品

番茄紅素參比樣品(P/N：L9879)由Sigma公司提供，純度為90%～95%，使用前應用C30-HPLC檢測其番茄紅素的幾何異構體組成。根據(jù)不同組分的峰面積比例，計算全反式異構體的比例大于99%。故未經(jīng)進一步純化而直接使用。

1.3 試劑

丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚、三乙胺(BP：6 0～9 0℃)(均為分析純)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(均為色譜純)。配制好的流動相在使用前用0.45μm的微孔濾膜(Millpore公司)過濾。配制流動相所用的水為經(jīng)過逆流滲透處理的超純水。

1.4 儀器與設備

HPLC由1525溶劑輸送系統(tǒng)、PDA-996二極管陣列檢測器組成(美國Waters公司)，系統(tǒng)的重復性良好。在6次以上的重復性檢測中，RSD＜5%；MultiSpec-1501型分光光度計 日本島津公司；半微量分析天平(0.00001g) Precisa公司；TP114(0.0001g)電子天平 Denver儀器公司。

1.5 參比樣品儲備液的配制

精確(0.00001g)稱取番茄紅素參比樣品1mg，加入1mL二氯甲烷溶解，轉移至10mL棕色容量瓶中，用石油醚定容至10mL，配制成100mg/mL的儲備液，保存于－20℃冰箱中。在24h之內使用石油醚配成質量濃度適當?shù)墓ぷ饕海糜贖PLC分析。

1.6 樣品制備

將200～250g同產地、色澤均勻的果實切成碎塊放入搗碎機中搗碎。搗碎時加入1g碳酸鈉以中和細胞破碎時釋放出的有機酸。稱取1g果實勻漿，加少量石英砂和4倍體積的丙酮研磨，靜置，用滴管小心移出上清液，重復6～8次萃取直至上清液和殘渣均為無色。合并收集上清液，用丙酮定容至30mL，轉入分液漏斗后加入等體積正己烷緩慢搖動，再加入等體積蒸餾水緩慢搖動，靜置10min，收集上相。用等體積蒸餾水洗滌上相2次，直至上相體積不再變化。收集上相，用氮氣吹干，并充氮氣保存于－20℃冰箱中，24h內用于HPLC分析。分析前用正己烷定容，0.45μm濾膜過濾。

1.7 樣品干質量測定

精確(0.0001g)稱取番茄果實勻漿于玻璃表面皿(φ= 10cm)中，在70℃真空(－0.08MPa)干燥箱中烘至質量恒定。用減重法稱量樣品干質量。每個樣品做6份平行，取平均值。

1.8 色譜條件

C30固定相：YMC Carotenoid column C30色譜柱(4.6mm×250mm，SOD-5μm)；流動相A：乙腈-甲醇(3:1，V/V)；流動相B：MTBE；流動相A與B中分別添加0.05%(V/V)的三乙胺；線性梯度洗脫：B在20min內由0增至80%，20～35min內B維持在80%；流速：1mL/ min；色譜圖監(jiān)測波長470nm；進樣量：20μL；柱溫：室溫[12]。

1.9 質量濃度-峰面積線性關系的測定

精確量取一定體積的參比樣品儲備液，用稀釋的方法配制成7個不同質量濃度的標準樣品液，分別為0.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00mg/mL。各取20μL進樣，在每個色譜圖上，對番茄紅素全反式異構體組分峰積分，得到峰面積，做質量濃度-峰面積線性回歸，得到回歸曲線和方程，計算R2值。

1.10 檢測下限的測定

按信噪比為2測定檢測下限。

1.11 重復性分析

配制質量濃度為50.00mg/mL的番茄紅素全反式異構體參比樣品工作液。重復HPLC分析6次。根據(jù)已測定的質量濃度-峰面積線性關系，計算質量濃度平均值和RSD。

1.12 回收率分析

在本研究中，采用添加法進行外標參比樣品回收率的分析。方法是將質量濃度為50.00mg/mL的番茄紅素全反式異構體參比樣品工作液添加到全反式番茄紅素濃度為0.49mg/mL的新鮮番茄果實萃取物中，使添加后樣品中的全反式番茄紅素的質量濃度是鮮果萃取物中的2倍，然后重復6次做HPLC分析。

1.13 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的制備與檢測重復6次，取平均值，RSD＜5%。

1.14 操作注意事項

由于番茄紅素分子的不飽和結構，使其具有極大的不穩(wěn)定性。在實驗室操作中最易發(fā)生的化學變化為幾何

(E/Z)異構化和環(huán)氧化。所以，在進行番茄紅素制備和檢測工作時，要遵循以下注意事項，同時操作過程要盡可能的快速。

避氧：使用惰性氣體對于番茄紅素的保護是非常有效的。在蒸發(fā)濃縮和保存時，使用氮氣(純度＞99.9%)或者氬氣。

避光：番茄紅素的所有操作和處理都必須避免陽光和紫外線的直射。所有的操作都應該在散射的自然光或者柔和的人工光下進行。番茄紅素的所有溶液都應當用棕色玻璃瓶盛放。

溫度控制：番茄紅素的一切操作過程都應該控制在盡可能低的溫度下。在－20℃以下條件下避光保存。如需使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮溶液，蒸發(fā)溫度須控制在45℃以下。

避酸：番茄紅素應嚴格避免與酸的接觸。

2 結果與分析

2.1 參比樣品的色譜行為、光譜特征和幾何異構體組成

圖2 番茄紅素參比樣品的C30-HPLC色譜行為Fig.2 Elution profile of lycopene standard separated by C30-HPLC

圖3 組分Ⅰ的電子吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectrum of fractionⅠ

對番茄紅素參比樣品進行C30-HPLC分離獲得的色譜圖(圖2)和組分Ⅰ的電子吸收光譜圖(圖3)。根據(jù)其色譜行為(保留時間)和光譜特征(最大吸收波長和光譜精細結構)確定組分Ⅰ為番茄紅素的全反式異構體[4-8]。圖2中組分峰面積的積分顯示，該參比樣品中全反式異構體組分(組分Ⅰ)的峰面積比例大于99%。因此，可以作為全反式異構體的參比樣品使用。

2.2 參比樣品質量濃度-峰面積的線性關系

圖4 番茄紅素全反式異構體組分的質量濃度與其峰面積的線性回歸Fig.4 Linear correlation between the concentration of all-translycopene and corresponding peak area

在C30-HPLC上測定番茄紅素全反式異構體組分與其峰面積的線性關系時，將7個不同質量濃度的標準樣品工作液分別進樣20μL。在每個樣品的色譜圖上計算全反式異構體組分的峰面積，得到線性回歸曲線圖4及回歸方程：y=212181x(R2=0.9738)。線性區(qū)間為10～100mg/mL。

2.3 檢測下限

按信噪比為2測定檢出下限為0.01mg/mL。

2.4 重復性分析

重復測定6次的參比樣品質量濃度的平均值為48.81mg/mL，RSD為4.04%。結果見表1。

表1 重復性分析實驗結果(n=6)Table1 Results of reproducibility experiments

2.5 回收率分析

表2 回收率分析實驗結果(n=6)Table2 Results of recovery rate experiments

本實驗采用添加法進行全反式番茄紅素參比樣品的回收率分析(C30系統(tǒng)分析結果見表2)。由表2結果與文

獻[13]中C18柱上的分析結果相比較可知，番茄紅素全反式異構體在C30柱上損失略高。其原因可能為按照“草叢”原理，全反式異構體與C30基團的吸附能力較與C18基團強[4]。

2.6 番茄果實中全反式番茄紅素的定量測定

圖5為河北滄州市7、8月產番茄果實萃取物的C30-HPLC色譜圖。根據(jù)其色譜行為(保留時間)和光譜特征(最大吸收波長和光譜精細結構)與參比樣品的比較，組分Ⅰ被鑒定為全反式番茄紅素。根據(jù)已有的報道[4-8]，組分Ⅱ鑒定為全反式β-胡蘿卜素。圖6為新疆庫爾勒市7、8月產番茄果實萃取物的C30-HPLC色譜圖。根據(jù)其色譜行為和光譜特征與參比樣品的比較，組分Ⅰ鑒定為全反式番茄紅素。根據(jù)其光譜特征和已有的報道[4-8]，組分Ⅱ被鑒定為5Z-番茄紅素，組分Ⅲ被鑒定為13Z-番茄紅素。從圖5可以看到，庫爾勒地區(qū)產的番茄果實中有相當數(shù)量的5-和13-順式異構體存在。從圖5、6的比較可以看出，不同產地的番茄中番茄紅素幾何異構體的比例有明顯區(qū)別。由于不同異構體的生物學功能和效價不同[12]，不同產地番茄果實中番茄紅素的生物學效價(甚至功能)亦可能出現(xiàn)差別。因此，在對番茄及其制品中番茄紅素的質量進行評估時，測定其幾何異構體組成是最理想的做法。由于全反式異構體在數(shù)量上的優(yōu)勢[2,14-15]，測定其中全反式異構體的數(shù)量具有極其重要的意義。表3為應用外標法測得不同產地鮮食型番茄中全反式番茄紅素的含量。

圖5 河北滄州市產番茄果實萃取物的C30-HPLC色譜行為Fig.5 Elution profile of extract from tomato fruits in Cangzhou separated by C30-HPLC

圖6 新疆庫爾勒市產番茄果實萃取物的C30-HPLC色譜行為Fig.6 Elution profile of extract from tomato fruits in Kuerle separated by C30-HPLC

表3 不同番茄中全反式番茄紅素的含量測定Table3 Contents of all-trans-lycopene from different kinds of tomato fruits

3 結 論

本研究表明，運用C30-HPLC外標法定量檢測番茄果實中全反式番茄紅素是切實可行的，這對確定不同番茄紅素源中番茄紅素順反異構體之間的比例，從而研究其生物學功能和效價具有重要的現(xiàn)實意義。

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Quantification of All-trans-lycopene from Tomato Fruits by C30-HPLC with External Standard Method

DING Jing，HUI Bo-di*，LIU Yuan
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

An external standard method was established to determine all-trans-lycopene on C30-HPLC. Stationary phase was YMCTM Carotenoid column C30 (4.6 mm × 250 mm, SOD-5μ m, Waters); mobile phase A was acetonitrile-methanol (3:1, V/ V); mobile phase B was methyl tert-butyl ether (MTBE); both mobile phase A and B were added 0.05% (V/V) triethylamine; linear gradient elution was conducted with an increase of mobile phase B from 0 to 80% (V/V) in 20 min followed by maintaining at 80% mobile phase B for 15 min; flow rate was 1.0 mL/min; monitoring wavelength was 470 nm; injection volume was 20μ L; column temperature was set at room temperature. Under these determination parameters, the minimum detection limit was 0.10μ g/mL; in the range of 10－100μ g/mL, linear correlation equation was y = 212181x (R2= 0.9738) with a RSD of 4.04%. The recovery rate of external standard was 97.34% with a RSD of 0.904%. Therefore, this established method is suitable for determining alltrans-lycopene in tomato fruits.

all-trans-lycopene；quantification；external standard；C30-HPLC

TS201.2

A

1002-6630(2010)22-0453-04

2010-07-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAI58B06)

丁靖(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail：ading1110@126.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn