噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)結(jié)核病臨床診斷的意義

張周云，熊國(guó)亮

(江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌 330006)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類身體健康的全球性傳染性疾病，我國(guó)結(jié)核病的發(fā)病率和病死率均較高，結(jié)核病的早期診斷和有效治療是結(jié)核病疫情控制的關(guān)鍵。因此，尋找快速、準(zhǔn)確可靠、陽(yáng)性率高的檢測(cè)方法是實(shí)驗(yàn)室研究的重要課題。為此我們應(yīng)用噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核病的臨床標(biāo)本，并評(píng)價(jià)其對(duì)結(jié)核病臨床診斷的應(yīng)用價(jià)值，為結(jié)核的快速診斷提供新的檢測(cè)手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 ①結(jié)核組：2007年6月至2008年10月為我院86例活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰標(biāo)本、73例結(jié)核性胸膜炎患者胸水、30例肺結(jié)核患者肺泡灌洗液，共計(jì)189份臨床標(biāo)本，其中男121例、女68例，平均年齡46.3歲。②非結(jié)核組：7例COPD急性發(fā)作、3例急性支氣管炎患者痰標(biāo)本，5例肺癌患者胸水，5例塵肺患者肺泡灌洗液，共計(jì)20份非結(jié)核患者標(biāo)本，其中男12例、女8例，平均年齡56.1歲。

1.2 試劑 (1)噬菌體檢測(cè)試劑：分枝桿菌噬菌體D29、指示細(xì)胞(恥垢分枝桿菌)、液體培養(yǎng)基、噬菌體殺毒劑(硫酸亞鐵胺)由英國(guó)BIOTEC Laboratories公司提供。(2)改良羅氏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]自配。

1.3 方法

1.3 .1 噬菌體生物擴(kuò)增法 按照FASTPlaque-TBTM試劑說明書配制所需試劑，包括痰、肺泡灌洗液等標(biāo)本處理液，培養(yǎng)基，噬菌體，敏感細(xì)胞等，所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。①標(biāo)本的前處理：待檢痰標(biāo)本、肺泡灌洗液先用3%NaOH溶液消化20min，再加磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)離心20min，棄上清液；胸水標(biāo)本4000r/min、離心10min，棄上清液，沉淀加1～2ml 3%NaOH混勻去污染10min，4000r/min、離心10min，棄上清液；腦脊液直接離心去上清液。②用液體培養(yǎng)基洗滌以上沉淀物2次，最后加入1ml液體培養(yǎng)基重懸沉淀物(確保打散)，無菌條件下轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管中為備用待檢菌液。③取噬菌體0.1ml與待檢菌液充分混勻，37℃孵育1h后加入0.1ml噬菌體殺毒劑，混勻，至室溫5min后加入5ml液體培養(yǎng)基和1ml指示細(xì)胞，顛倒混勻一次。上述混合培養(yǎng)液與5ml已溶解瓊脂液(55±2℃)混勻后立即傾入無菌平皿中，旋轉(zhuǎn)混勻，待凝固成形后，平放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h判讀結(jié)果，每次檢測(cè)要同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照平皿。④結(jié)果觀察：在各對(duì)照組結(jié)果正確的條件下，觀察檢測(cè)標(biāo)本結(jié)果。陽(yáng)性平皿中可見大小數(shù)量不等的透明狀噬菌斑、或許多噬菌斑相互融合成透明狀；陰性結(jié)果可見指示細(xì)胞在瓊脂培養(yǎng)基中均勻分布、無噬菌斑出現(xiàn)。⑤結(jié)果判定：陽(yáng)性結(jié)果≥20個(gè)噬菌斑；陰性結(jié)果＜20個(gè)噬菌斑。

1.3 .2同份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行離心涂片抗酸染色鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)，其操作方法按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 三種方法對(duì)189例臨床標(biāo)本檢出的陽(yáng)性率分別為：噬菌體生物擴(kuò)增法52.91%(100/189)；涂片抗酸染色15.34%(29/189)；羅氏培養(yǎng)27.51%(52/189)。噬菌體生物擴(kuò)增法與涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性檢測(cè)率比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(χ2=59.32、P＜0.005，χ2=25.35、P＜0.005)。 結(jié)果詳見表 1。

表1 三種方法對(duì)189例各類臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

2.3 20例非結(jié)核患者標(biāo)本噬菌體生物擴(kuò)增法，涂片抗酸染色，羅氏培養(yǎng)均未檢測(cè)出陽(yáng)性。

3 討論

3.1 目前，結(jié)核病的診斷方法很多，抗酸染色涂片法是目前最廣泛采用方法之一，該方法檢測(cè)速度快，價(jià)格低廉，能檢出含菌量較高的標(biāo)本，但對(duì)含菌量較低的胸腔積液、腦脊液等標(biāo)本的檢出率相對(duì)較低，無法早期診斷結(jié)核病。羅氏培養(yǎng)的陽(yáng)性率雖高于涂片法但培養(yǎng)時(shí)間很長(zhǎng)，難以達(dá)到臨床上需要快速檢測(cè)的目的。

3.2 近年來分枝桿菌噬菌體結(jié)核病快速診斷的研究報(bào)道很多[2～4]，該方法的基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，未進(jìn)入感染菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響，噬菌體在感染菌體內(nèi)大量增殖，并將菌體裂解，釋放出的子代噬菌體可感染隨后加入的指示細(xì)胞，并將其裂解，在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑，因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無即可判斷待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間只需2天。本實(shí)驗(yàn)資料對(duì)189例臨床結(jié)核標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果：噬菌體生物擴(kuò)增法陽(yáng)性率52.91%(100/189)，遠(yuǎn)高于涂片抗酸染色陽(yáng)性率15.34%(29/189)和羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率27.51%(52/189)；特異性為100%。涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率都集中在痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本，但噬菌體生物擴(kuò)增法不僅對(duì)痰液、肺泡灌洗液標(biāo)本有較高的檢出率而且對(duì)結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本也有較高的檢出率(49.30%)。

綜上所述，噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)對(duì)結(jié)核病診斷具有快速、特異性和敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，該方法能為結(jié)核的快速診斷提供新的檢測(cè)手段，并具有推廣的應(yīng)用價(jià)值。

[1]中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志,1996,18(1):28～31.

[2]McNerney R.TB:The return of the phage.A review of fifty years of mycobacteriophage research[J].Int Jtuberc Lung Dis,1999,3:179～184.

[3]靳安佳,王 潔,胡忠義，等.噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本臨床應(yīng)用研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(8):807～808.

[4]四種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病臨床診斷價(jià)值的探討[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,30(7):742～745.