國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)檢測睪酮的臨床驗證

林 云 ，汪先桃 ，劉 萍

(1、云南省中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650021；2、博奧賽斯(天津)生物科技有限公司，天津 300203)

以往全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)主要以國外產(chǎn)品為主，而隨著國內(nèi)科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展和衛(wèi)生保健事業(yè)的需要，國內(nèi)開始了全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)研發(fā)工作，并有產(chǎn)品推出。為評價國產(chǎn)Bioscience PETECK96-I全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)與羅氏電自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)檢測睪酮(Testosterone,以下簡稱T)是否等效，研究按照國家關(guān)于新藥臨床驗證的指導(dǎo)原則和體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則[1]、NCCLS指南文件[2]，進(jìn)行該系統(tǒng)檢測睪酮的臨床性能測試。

1 材料與方法

1.1 材料 對照系統(tǒng)：羅氏公司化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀 Elecsys2010，國藥管械(進(jìn))字 2002第3400335號。配套T檢測試劑盒，國食藥監(jiān)械2008第2400661號，試劑盒批號：155387-02，參考值：男性 2.8～8ng/mL，女性 0～0.82ng/mL。 驗證系統(tǒng)：博奧賽斯 (天津)生物科技有限公司Bioscience PETECK96-I化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。試劑：為配套T試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢測樣品 根據(jù)國家關(guān)于體外診斷試劑盒二類臨床試驗的要求，收集了120例樣本，均來自本院就診的門診及住院病人。樣本均為空腹時抽取的靜脈血，自然凝血后，離心分離出血清，去除嚴(yán)重溶血、脂血、黃疸的樣本于-20℃保存，每份標(biāo)本不少于500μl。所有待測樣本濃度均應(yīng)≤20ng/ml，其中超出醫(yī)學(xué)決定水平值樣本50例。

1.2.2 臨床試驗對照產(chǎn)品的確定 羅氏公司生產(chǎn)的化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)可以定量檢測T，經(jīng)國內(nèi)外同行的評價，認(rèn)為此系統(tǒng)及其配套T檢測試劑盒為國際一流的水準(zhǔn)[3]，因此，本臨床試驗以Roche 2010電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)(Elecsys 2010)對T的測定值作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，以此考查天津博奧賽斯公司研制的Bioscience PETECK96-I化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)使用其配套T檢測試劑盒的檢測結(jié)果是否等效。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對Elecsys2010的測定值和Bioscience PETECK96-IT的測定值兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗(檢驗水準(zhǔn)α=0.05)、線性相關(guān)和回歸分析并評價。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性

用試劑盒對試劑盒校準(zhǔn)品進(jìn)行雙孔檢測，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，對兩條劑量-反應(yīng)曲線進(jìn)行斜率t檢驗；以國家標(biāo)準(zhǔn)品系列為標(biāo)準(zhǔn)，計算試劑盒校準(zhǔn)品的實測濃度，并計算5個校準(zhǔn)品實測濃度與理論濃度比值的平均值。結(jié)果見表1。

斜率t檢驗結(jié)果t=1.21，∣t∣≤2.447，兩條直線不明顯偏離平行；實測濃度與理論濃度平均差異小于10%，說明試劑盒校準(zhǔn)品定值準(zhǔn)確。試劑盒校準(zhǔn)品相關(guān)系數(shù)絕對值∣γ∣＞0.99線性良好。

表1 準(zhǔn)確性：試劑盒校準(zhǔn)品檢測結(jié)果

2.2 精密性

用三批試劑盒對質(zhì)控品QcL和QcH進(jìn)行10孔重復(fù)測定，統(tǒng)計實驗結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和平均值。由SD和 的比值計算得到批內(nèi)和批間的變異系數(shù)CV。結(jié)果見表2。

表2 精密性

由上表知本產(chǎn)品的批內(nèi)CV小于15%，批間CV小于20%。

2.3 參考范圍的測定

選擇1186份健康人群血清樣品，其中成年男性132例、成年女性956例和男性兒童98例，建立90%置信區(qū)間。結(jié)果見表3。

表3 參考范圍

2.4 特異性測試

臨床上T的主要類似物是雌三醇(E3)和雌二醇(E2)，孕酮(P)。 用二甲亞砜分別溶解 E3、E2、P，然后用稀釋液2#分別稀釋到1000ng/mL，用試劑盒檢測。結(jié)果見表4。

表4 交叉反應(yīng)

當(dāng) E3、E2、P 的濃度分別為 1000、1000、1000ng/ml時，沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2.5 試劑盒測定范圍及最低檢測限

實驗方法：將T濃儲液稀釋成系列濃度，加樣量為每孔50μl；然后每孔加入50μl的T酶結(jié)合物，37℃溫育30分鐘，洗滌5次，每孔加發(fā)光液100μl，5min后讀數(shù)。結(jié)果見表5。

表5 試劑盒測定范圍及最低檢測限數(shù)據(jù)表

試劑 在0.1～20ng/mL范圍內(nèi)成線性發(fā)展，試劑盒最低檢測限可達(dá)0.1ng/ml。

2.6 兩種系統(tǒng)測定值配對t檢驗統(tǒng)計分析 結(jié)果見表6。

表6 兩種方法測定值比較

2.7 兩種系統(tǒng)測定值相關(guān)性分析

以Elecsys2010的測定數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Bioscience PETECK96-I的測定數(shù)值為縱坐標(biāo)，利用EXCEL軟件做圖(圖1)，計算相關(guān)系數(shù)γ和回歸系數(shù)并進(jìn)行t檢驗。直線方程為Y=1.0348X–0.0335，線性回歸系數(shù)為1.0348，相關(guān)系數(shù)為0.9413。以SPSS 13.0對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行 t檢驗 (檢驗水準(zhǔn)α=0.05)，P＜0.001，兩種方法測定的T值密切相關(guān)。回歸系數(shù)為1.0348，表明兩種方法之間測定的T值一致性良好。

2.8 測定值不一致的分析

經(jīng)對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，120例樣本中有6例測定值結(jié)果不一致(占5.0%)，對于不符合的樣本，經(jīng)重復(fù)性檢測，測定值沒有明顯改變。使用Elecsys2010進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測2例與Elecsys2010結(jié)果一致，4例與Bioscience PETECK96-I結(jié)果一致(見表7)。經(jīng)分析沒有規(guī)律性的偏差產(chǎn)生，多為臨界偏差，所以考慮產(chǎn)生不一致的原因主要可能由樣本病例的個體差異、兩種方法測定原理的差別及操作隨機(jī)誤差造成的。

表7 兩種不同檢查方法吻合度對比

3 討論

T是男性激素，T促進(jìn)男性第二性征的發(fā)育，維持前列腺和精囊的功能。血循環(huán)中的T絕大多數(shù)與載體蛋白質(zhì)結(jié)合[4]，T在體內(nèi)的含量不高。CLIA法是利用抗原抗體間免疫反應(yīng)的高親和力、高度特異性和化學(xué)發(fā)光的高敏感性建立起來的一種微量免疫定量測定技術(shù)，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法檢測T濃度具有靈敏度高、線性檢測范圍寬、操作簡單、定量和穩(wěn)定的優(yōu)點[5]。

Bioscience PETECK96-I的配套T定量檢測試劑盒采用競爭抑制法，以辣根過氧化物酶(HRP)為標(biāo)記物，樣品中的T濃度依據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)品T濃度建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量，從而檢測人血清中T的含量。

檢測儀器的系統(tǒng)性能測試數(shù)據(jù)是臨床實用的重要指標(biāo)，每一項測試必須按照國家關(guān)于新藥臨床驗證的指導(dǎo)原則和體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則和NCCLS指南文件嚴(yán)格操作。

Bioscience PETECK96-I測定T的精密度 CV<20%，參考范圍符合臨床應(yīng)用，臨床常見干擾物質(zhì)對T的檢測，無統(tǒng)計學(xué)意義，臨床線性范圍為0.1～20ng/ml，能達(dá)到臨床檢測要求。比對試驗中，同組測試中采用Roche 2010電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)(Elecsys 2010)對T的測定值與天津博奧賽斯公司研制的Bioscience PETECK96-I化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)使用其配套T檢測進(jìn)行對比試驗。兩組數(shù)據(jù)比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組數(shù)據(jù)線性回歸系數(shù)為1.0348，相關(guān)系數(shù)為0.9413總體可比性較好。Bioscience PETECK96-I的靈敏度、特異性高，測定結(jié)果穩(wěn)定。

綜合研究結(jié)果分析，Bioscience PETECK96-IT定量檢測與Elecsys 2010對T的測定值等效，該系統(tǒng)達(dá)到臨床測定要求，可用于臨床檢測。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局令(第3號).藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范[S].北京:國家食品藥品監(jiān)督管理局,2003.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute．EP9-2A，Method comparison and bias estimation using patient samples，approved guideline[S].Pennsylvania.CLSI,1986.

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[5]尹東光,賀佑豐.促甲狀腺激素化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究[J].分析化學(xué),2004,32(7):45-47.