改良布氏肉湯用于解脲脲原體的保種研究

劉光金，李樂平，張日妹

(深圳市龍崗區(qū)平湖人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518111)

改良布氏肉湯用于解脲脲原體的保種研究

劉光金，李樂平，張日妹

(深圳市龍崗區(qū)平湖人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518111)

解脲脲原體；保存；布氏肉湯；改良

解脲脲原體(mycoplasma urealytium)是臨床上引起非淋菌性尿道炎最為常見的病原體之一，能引起男性和女性泌尿生殖道的急性和慢性感染，是導(dǎo)致男性不育和女性繼發(fā)不孕的重要原因[1]，因此對于解脲脲原體各方面生物學(xué)特性的研究逐漸成為研究解脲脲原體的重點。在研究解脲脲原體各生物學(xué)特性的過程中，必然涉及到臨床分離菌株的保存和傳代問題，吳漢勇等[2]曾利用甘油培養(yǎng)液短期保存溶脲脲原體，為了探討能更長時間保存解脲脲原體的方法，筆者采用改良布氏肉湯保存解脲脲原體，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 病例為深圳市龍崗區(qū)平湖人民醫(yī)院性病科、泌尿科及婦科就診的患者，病史中否認(rèn)近1周內(nèi)使用過抗生素，具有非淋菌性尿道炎的癥狀和體征。其中男性患者主訴尿痛、尿頻、尿急伴尿道灼熱感，體征有尿道口有糊狀分泌物。女性患者主訴陰道分泌物增多并有異味，體征檢查宮頸有膿性分泌物，伴宮頸充血。用無菌棉拭子取材，其中男性患者取尿道分泌物或前列腺液，拭子插入尿道1～2cm，停約5～10s。女性患者取宮頸分泌物以及宮頸拭子，首先用一根拭子拭去宮頸口的黏液，再用另外一根拭子取材，插入宮頸約2～3cm，停約5～10s。標(biāo)本采集后立即接種到 珠海市銀科生物技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的支原體藥敏試劑瓶中。置37℃溫箱，5%～10%CO2培養(yǎng)24～48h。共收集臨床分離株96株。

1.2 保存液成分 采用改良的布氏肉湯培養(yǎng)基保存臨床分離株。參考張卓然等[3]的布氏肉湯配方配制，改良的布氏肉湯培養(yǎng)基的配方：胰胨10g，眎胨10g，NaCl 5g，重亞硫酸鈉0.1g，葡萄糖 10g，酵母浸膏 2g，加入 0.4%的酚紅 10ml，并用3%的鹽酸調(diào)pH值至6.0，分裝至每瓶70ml，15磅高壓蒸汽滅菌15～20min，冷卻后每瓶加入20%的無菌小牛血清20ml，25%的鮮酵母浸液 10ml，2%鹽酸半胱氨酸 100μl，2%尿素4ml，20 萬 U/ml的青霉素 0.5ml，5g/L 多粘菌素 B0.1ml， 校正pH至6.0。將分裝好的培養(yǎng)基凍入-20℃冰箱。臨用前分裝至無菌試管中，1.5～2ml/管至4℃冰箱備用。

1.3 培養(yǎng)與保存方法

臨床標(biāo)本培養(yǎng)24h后或48h后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色轉(zhuǎn)紅，并且培養(yǎng)管澄清，立即進行移種，用移液槍吸取50μl加入到配制好的改良布氏肉湯培養(yǎng)管中，每株臨床分離株移種16 管，置 37℃溫箱、5～10%CO2培養(yǎng) 24～48h。 24h 后，若培養(yǎng)基顏色微轉(zhuǎn)紅，培養(yǎng)管澄清，立即取出并立即凍入-20℃冰箱(8支/株)和-70℃冰箱(8支/株)。定期復(fù)蘇，觀察成活情況。

2 結(jié)果

臨床分離株在不同溫度相同保存時間后成活情況，在-20℃冰箱保存時，32周和 48周存活率分別為 90.69%和86.5%，但72周存活率僅有54.2%。在-70℃冰箱保存時，32周和48周周存活率都為100%，而且72周存活率達96.9%，并且96周的存活率也達94.8%，而-20℃冰箱保存時只有13.5%。

3 討論

由于目前臨床上由解脲脲原體引起的非淋菌性尿道炎的發(fā)病率日趨上升，在歐美國家已經(jīng)居性傳播疾病之首。而在對患者治療的過程中，抗生素的耐藥現(xiàn)象也逐漸出現(xiàn)并呈增加趨勢，并且發(fā)現(xiàn)臨床分離解脲脲原體菌株的一些生物學(xué)性狀也發(fā)生改變。因此加強對臨床分離株各種生物學(xué)性狀的研究，有助于臨床診斷和治療措施的選擇。而在研究的過程中，如何對分離的臨床株進行保存又顯得尤為重要。本研究采用改良的布氏肉湯培養(yǎng)基保存臨床分離株，從結(jié)果可以看出其-20℃冰箱保存時間可達48周，而-70℃冰箱的保存時間96周左右，保存效果良好，明顯優(yōu)于吳漢勇等[2]利用甘油培養(yǎng)液保存溶脲脲原體的方法。并且發(fā)現(xiàn)在相同的保存培養(yǎng)基條件下-70℃低溫保存效果明顯較-20℃保存好(P＜0.05)。而且培養(yǎng)基中采用青霉素和多粘菌素替代了毒性強烈的醋酸鉈，易在普通實驗室使用。在采用珠海市銀科生物技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的支原體藥敏試劑對臨床標(biāo)本進行初次分離后再傳代本培養(yǎng)基時，陽性率達100%。因此，改良的布氏肉湯培養(yǎng)基是實驗室保存臨床分離解脲脲原體株的一種可行方法。

[1]楊麥貴,張竹映,鄭善鑾,等.精液中溶脲脲原體與不育癥相關(guān)[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,12:21.

[2]吳漢勇,吳發(fā)龍.解脲支原體保存方法探討[J].福建醫(yī)藥雜志,1997,19:6.

[3]張卓然.醫(yī)學(xué)微生物實驗學(xué)[J].第2版,北京:科學(xué)出版社,2005:215-216.

R375+.1,R446.5,R518.9

B

1674-1129(2010)06-0649-01

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.06.065