糖尿病腎病診斷生物標志物研究新進展

(東南大學腎臟病研究所，東南大學附屬中大醫院腎科，江蘇南京 210009)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發癥，以持續蛋白尿、腎功能進行性下降和高心血管疾病發病率及死亡率為特征［1］。據估計，2030年全世界糖尿病患者數量將從2000年的1.71億增加到3.66億，其中30% ～40%的2型糖尿病將發展為DN，20% ～40%的1型糖尿病15～30年后也將發展為DN［2］，DN已成為引起終末期腎衰最常見的原因之一。如何早期發現DN，并進行早期干預是臨床上迫切需要解決的問題。盡管腎活檢是早期明確診斷DN的金標準，但作為一項創傷性和技術復雜的檢查，它難以普及和臨床反復進行。因此積極尋找DN早期診斷生物標志物(biomarker)將具有非常重要的臨床意義，為此國內外近年來進行了大量的實驗和臨床研究，作者簡要綜述有關進展。

1 DN診斷中的生物標志物

1.1 微量白蛋白尿(microalbuminuria，Malb)

長期以來，DN早期診斷臨床上主要依賴Malb測定。正常情況下，腎小球濾過膜存在電荷選擇性屏障，在靜電同性排斥作用下，絕大多數的白蛋白不能通過濾過膜。而在DN早期，由于腎小球濾過膜帶負電荷的乙酰硫酸肝素、唾液酸等成分減少，使腎小球濾過膜的電荷選擇性降低，并干擾了蛋白多糖與細胞外基質間親和力。此外，最近研究表明高糖環境可致腎小球內皮細胞外被的多糖蛋白復合物受到破壞，致使腎小球濾過膜上濾孔孔徑增大以及腎小球濾過膜富含帶負電荷的結構成分改變［3-4］;細胞因子和生長因子通過多途徑改變血流動力學應力導致DN結構改變，足細胞增寬伴隨每個腎小球足細胞數量減少，從而導致白蛋白在尿中排出增多。Sampaio等［5］應用免疫比濁法對293例糖尿病患者進行橫斷面研究表明，當尿白蛋白濃度(UAC)界定值為22 mg·L-1時，敏感性為82.5%，特異性為74%，當尿白蛋白/尿肌酐(UACR)界定值為27.3 mg·g-1時，敏感性為83.3%，特異性為80.9%。而UAC低界定值(10 mg·L-1)雖然其敏感性提高(94.2%)，但特異性顯著降低(48.6%)，UACR也是如此。研究表明，UAC和UACR在反映Malb水平的變化中其精確性相似，對1型和2型DN診斷的敏感性也無差異。

大多數研究認為，Malb程度與DN的預后密切相關。日本學者通過對5 449例糖尿病患者進行5年隨訪，監測其尿白蛋白與肌酐的比值(ACR)，發現ACR升高即使只在正常高限，也可預測腎小球濾過率估測值(eGFR)的下降［6］。但是，最近研究發現，只有30%～45%的Malb患者在10年內會進展為蛋白尿［7］，而且，臨床許多情況下(如運動、發熱、原發性腎臟病、感染等)Malb也可以顯著升高。因此，Malb作為DN診斷生物標志物其特異性和對疾病嚴重程度的預測價值受到質疑。

1.2 免疫球蛋白(IgG和IgM)

IgG是血液中主要免疫球蛋白，多數以單體形式存在，主要由脾和淋巴結合成，不經腎小球濾過，故正常人尿液中含量極低。日本學者認為IgG升高范圍與腎小球破壞程度呈正相關，且在DN早期，Malb正常時IgG已明顯升高，對早期DN診斷有意義。IgG 4個亞型中IgG4帶負電荷，當電荷屏障受損時，可見IgG4與白蛋白排泄率呈正相關，特別是IgG4/IgG之值意義更大，在DN晚期，由于腎小球機械屏障損害，IgG排出增多，IgG4/IgG之值下降。因此IgG4、IgG4/IgG之值可反映早期DN電荷屏障的損害。

IgM是分子量較大的免疫球蛋白(分子量為120?)，尿中IgM的出現往往反映腎小球濾過屏障嚴重受損［8］。Rafid等［9］對139例1型糖尿病患者進行了長期隨訪(平均隨訪期18年)，發現患者的生存率和腎臟存活率與白蛋白排泄(RR=2.9/5.8)和尿IgM排泄有關(RR=4.6/5.7)，分層分析提示，不同程度的蛋白尿患者心血管疾病的死亡率和ESRD的發生率隨著尿IgM排泄的增多風險顯著增高(3倍左右)。DN患者無論是早期還是晚期，尿液IgM排泄增加，其心血管病死亡率和腎衰的風險性均顯著提高，提示尿液IgM的排泄是DN患者心血管疾病死亡率及ESRD獨立預測因子。

1.3 尿足細胞相關生物標志物

最近大量研究表明，足細胞損害在DN發生發展中起非常關鍵的作用。一方面，DN進展過程中高糖、高血脂、糖基化終末產物(AGEs)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧簇(ROS)、轉化生長因子-β(TGF-β)和機械應力的增加對足細胞直接造成損傷，導致足細胞密度減少、體積增大和足細胞特異性蛋白表達改變［10］;另一方面，足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成成分，其形態結構及相關分子改變必然促進蛋白尿的發生［11］。Jennifer等［12］通過對 OVE26 轉基因糖尿病大鼠研究發現，足細胞改變可能在DN失代償期才增加濾過屏障的通透性。

足細胞位于腎小球毛細血管外側，故當腎小球受損時足細胞脫離腎小球基底膜，在尿中可檢測到。有學者認為，尿液中足細胞檢測有助于對腎小球損傷嚴重程度的判斷，但其技術復雜。近年來人們通過對足細胞標記蛋白和基因的檢測，有可能更加便捷地了解DN不同階段足細胞的損害。

nephrin是裂孔隔膜上發現的第一個跨膜蛋白，由足細胞表達、構成裂孔隔膜拉鏈樣結構，與podocin、CD2AP組成復合體，維持裂孔隔膜結構的完整，阻止蛋白濾出。研究發現，DN患者腎小球nephrin mRNA表達減少，引起足細胞損傷脫落，濾過屏障功能破壞，通透性增加，尿蛋白排出增加［13］。Wang 等［14］通過檢測DN患者尿沉渣中足細胞相關分子(nephrin、podocin和synaptopodin)的mRNA，發現其表達升高，應用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)和AngⅡ受體阻滯劑(ARB)治療后，逆轉錄定量-聚合酶鏈反應(qRTPCR)證實尿液沉渣中nephrin mRNA排泄減少，尿液中podocin表達的改變可能與DN預后有關［15］。

1.4 尿Smad1

DN最主要的形態學改變是腎小球基底膜(GBM)增厚和系膜基質擴張，Takeshi等［16］在體外實驗中證實，Smad1作為膠原4中α1和α2的轉錄因子可以上調膠原4的表達，活化腎小球硬化相關分子如膠原特異性伴侶熱休克蛋白47、骨橋蛋白、1型膠原、α-SMA等。鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠在24周系膜基質擴張，腎小球Smad1表達升高與系膜基質擴張程度一致。腎小球Smad1表達與腎小球膠原4和α-SMA表達一致，而蛋白尿、GFR與系膜基質擴張無關。表明Smad1可以上調膠原4和α-SMA的表達，而膠原4是系膜基質擴張的重要組成物質，因此Smad1在DN系膜基質擴張中起重要作用。他們認為Smad1可能比Malb更好地預測DN的系膜基質擴張，可以作為DN系膜基質擴張的診斷標志物。

Akira等［17］對STZ誘導糖尿病小鼠和db/db糖尿病大鼠尿液Smad1水平進行觀察，發現4周時小鼠尿Smad1水平與24周時系膜基質擴張相關，而蛋白尿與系膜基質擴張無明顯相關。Olmesartan(奧美沙坦)治療可顯著改善腎小球硬化和降低尿Smad1水平。同樣地，在db/db大鼠，6周時尿Smad1與18周時系膜基質擴張有關。因此認為糖尿病早期階段尿液Smad1的增加與腎小球硬化有關，Smad1可作為新標志物預示DN晚期出現的系膜擴張。

雖然很多報道都提及Smad1的激活機制，但是只有相當少的報道提示相關因子可以上調Smad1的表達，如AGEs與糖尿病腎小球Smad1的表達呈正相關［16］。Takeshi等［16］同樣發現在糖尿病大鼠中腎小球TGF-β和激活素受體樣激酶-1(ALK-1)的表達增加，但是沒有發現TGF-β和ALK-1與腎小球Smad1表達有直接關系。

1.5 尿液炎癥標志物

傳統認為代謝和血流動力學改變是導致DN損傷的主要原因，現在越來越多的證據表明，炎癥因子介導的免疫反應在DN發展進程中起重要作用［18］。多種細胞，包括白細胞、單核細胞和巨噬細胞，還有其他一些分子如趨化因子(單核細胞趨化蛋白-1，MCP-1)、黏附分子(細胞間黏附分子-1，ICAM-1)、酶類(環氧酶-2，COX-2;一氧化氮合酶，NOs)、炎癥因子(血管內皮生長因子，VEGF;生長激素，GH;胰島素樣生長因子，IGF;TGF-β)和核因子(核因子-κB，NF-κB)都與 DN進程有關［19-21］，但是炎癥因子對糖尿病患者腎損傷的作用機制知之甚少。在眾多的炎癥因子中白介素(IL)-1、IL-6、IL-18和TNF-α與DN進展的關系較為明確［21］，其對DN并發癥的進展也有多種作用，它們在微血管病變中有時甚至起著決定性的作用［22-23］。此外，流行病學調查顯示炎癥參數可以很好地預測DN進展。

Wolkow等［24］用Luminex 100 platform聯合酶聯免疫法(ELISA)的方法檢測1型糖尿病合并Malb患者尿液標本中 IL-8、干擾素 γ誘導蛋白-10(IP-10)、MCP-1、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-1δ(MIP-1δ)5 種尿炎癥標志物，發現腎功能下降者上述5種炎癥因子的濃度均高于腎功能正常者。多變量分析提示，兩種標志物同時升高時腎功能受損的風險會增加5倍。提示腎臟炎癥在1型DN的進展中起重要作用。

Tesch［25］認為 MCP-1/CCL-2 是 DN 腎臟炎癥、損傷、纖維化的始動者，尿MCP-1水平可以用來評估糖尿病腎臟炎癥程度，可能對新療法或聯合治療效果評估有診斷價值［26］。此外，在嚙齒動物上做的基因缺失和分子阻斷實驗證實MCP-1是阻斷2型糖尿病進展的重要治療目標。還有證據表明人類MCP-1基因多態性與DN進展密切相關，這可能預示這些基因是DN的危險因素［27］。

2 DN診斷中的新技術-蛋白質組學(proteomics)

以蛋白質組學技術為手段，比較正常腎臟組織與病變腎臟組織中蛋白質水平的差異，或健康者尿樣/血漿與腎臟病患者尿樣/血漿中蛋白質水平差異，大大提高了DN診斷的陽性率，并有助于理解病理生理學機制。蛋白質組學技術包括蛋白質分離和鑒定技術。二維凝膠電泳(2-DE)是蛋白質分離的基本方法，電噴霧質譜(ESI-MS)和互助輔助激光解吸、離飛行質譜(MALDI-TOF-MS)技術是蛋白質鑒定的核心技術，它的特點是高靈敏度、快速、直接提供樣品的分子量和結構信息并可與色譜連用。Kiga等［28］利用這一技術觀察到，在2 000～10 000 Da范圍內伴有DN的自發性糖尿病WBN/Kob大鼠血漿中顯示80個峰，與對照的Wistar大鼠相比，其中質量電荷比(m/z)為4 678、4 732、4 808、9 058、9 323 和9 465 的蛋白峰強度高，使用Hachimi-jio-gan后血糖水平沒有改變而DN改善，上述差異表達蛋白質峰同時發生改變，而m/z為5 067、5 279、7 598和7 917的質譜峰沒有改變。研究結果提示 m/z為 4 678、4 732、4 808、9 058、9 323 和9 465的蛋白質可能參與DN的發生發展，且與achimijio-gan的治療靶點有關。

Sanju等［29］應用蛋白質組學技術構建蛋白質數據庫，以建立DN預測體系。他們用2-DE法從32例患有局灶節段性腎小球硬化(FSGS)、狼瘡腎、膜性腎病或DN的患者中分離出兩種尿蛋白。其中16例患者的尿蛋白被用來構建這個數據庫，用另外16例患者的尿蛋白驗證預測體系的準確性。結果表明此方法診斷以上疾病的敏感性在75%～86%之間，特異性在92% ～76%之間。Kasper等［30］在305個病例中，通過毛細管電泳法及電板離子化質譜分析法，用盲法定義并證實了一組由40種生物標志物構成的數據，可將糖尿病患者從正常人中區分出來(敏感性89%，特異性91%)。在這些糖尿病患者中，糖尿病伴正常蛋白尿患者與DN患者有102種尿生物標志物有顯著差異，一個包含了其中65種生物標志物的模版可以極其靈敏地識別DN(敏感性97，特異性97%)，并將DN和其他慢性腎臟疾病區分開來(敏感性81%，特異性91%)。這個研究顯示，應用蛋白質組學技術進行尿蛋白分析可以為DN提供早期診斷。

3 展 望

DN生物標志物研究對于早期診斷DN具有非常重要的價值，盡管目前已經發現許多具有潛在價值的DN診斷生物標志物，但其對DN進展的預測價值尚未經過循證醫學實驗驗證。雖然蛋白質組學技術已初步應用于DN生物標志物的研究，但仍存在許多技術性問題，如正常尿液蛋白含量低，對其濃縮技術還不完善;對不同疾病狀態下尿液分析還缺乏充分的標準圖譜等。隨著技術不斷改進，相信不久的將來，人們必將發現更多與DN病理生理過程密切相關、并能夠準確預測DN疾病進展和嚴重程度的生物標志物，從而為DN早期診斷和治療提供更多有價值的生物學信息。

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