催產素預處理對胎鼠海馬腦片缺氧無糖損傷后OTR、GABAARβ1表達的影響

陸廷鳳，于紅

(1.東南大學醫學院，江蘇南京 210009;2.東南大學附屬中大醫院 婦產科，江蘇南京 210009)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic－ischemic encephalopathy，HIE)是圍產期缺氧、窒息導致腦的缺氧缺血性損害，臨床出現一系列中樞神經系統異常表現的疾病，是引起新生兒死亡的主要原因之一，也是引起嬰幼兒神經系統后遺癥狀的重要原因。各家報道HIE的死亡率和致殘率仍為10%～30%。范曉梅［1］在對12 000名活產兒進行調查中發現，HIE的發病率為1%，其中以胎兒窘迫為主要病因，占HIE發病的91.7%。大腦被剝奪氧和葡萄糖后可引起神經元損傷和死亡，當神經和神經膠質細胞處在發育時期，這種損傷就更為嚴重［2］。催產素(oxytocin，OT)是一種古老的內分泌激素，早期對OT的研究多側重于其在分娩發動、乳汁分泌等方面的作用，近年來學者逐漸重視OT與神經精神系統發育的相關性研究。本實驗室曾報道OT對孕晚期胎鼠海馬缺氧無糖損傷(oxygen and glucose deprivation，OGD)有神經保護作用，其機制可能與γ－氨基丁酸(GABA)有關［3］。現進一步圍繞OT對OGD胎鼠海馬催產素受體(oxytocin receptor，OTR)、γ－氨基丁酸 A 受體 β1 亞基(gamma－amimobutyric acid receptor A β1 subunit，GABAAR β1)表達的影響，探討OT在胎兒神經保護方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

1.1.1 實驗動物 孕齡20 d SD大鼠4只，體重500～800 g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。

1.1.2 試劑及器材 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol·L－1)［4］:葡萄糖 10.0、NaCl 120.0、KCl 3.33、NaH2PO41.25、MgSO42.4、NaHCO326.0、CaCl22.5;通入 95%O2+5%CO2混合氣體至少30 min達到飽和，流量約為200 ml·min－1，HCl調至 pH 7.35 ～7.45。缺氧無糖人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid/oxygen and glucose deprivation，ACSF/OGD):將混合氣體95%O2+5%CO2換為95%N2+5%CO2，并且將ACSF中的葡萄糖換為同濃度的蔗糖。OT(上海第一生化藥業)，OTR兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德)，GABAAR β1兔抗大鼠多克隆抗體(Bioworld公司);SP免疫組化試劑盒(北京四正柏生物公司);數顯恒流泵(上海滬西分析儀器廠);混合氣體95%O2+5%CO2、95%N2+5%CO2(南京特種氣體)。

1.2 方法

1.2.1 離體海馬腦片制備 孕鼠乙醚吸入麻醉，2%碘酒及75%乙醇消毒腹部剖腹取出胚胎，剝除胎盤完全暴露胎鼠，斷頭取腦后置于0～4℃ACSF中降溫1 min。用刀片冠狀面切割全腦制作1～2 mm腦片，保留包含海馬的腦片，共得包括海馬區腦片40片。將腦片轉移至溫度為(32.0±0.5)℃的ACSF中，不斷通入95%O2+5%CO2混合氣體，流量為 200 ml·min－1，孵育2～3 h備用。

1.2.2 實驗分組和給藥方法 實驗用海馬腦片共40片，對照組和實驗組各20片。對照組用正常ACSF孵育2 h，待其充分作用后通入 ACSF/OGD，行OGD 15 min。實驗組則將正常 ACSF換成含10－6mmol·L－1OT的ACSF孵育，余同對照組。

1.2.3 評價

1.2.3.1 蘇木素－伊紅染色 海馬腦片經4%甲醛固定后，24 h內常規石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅染色制片。切片光學顯微鏡40×10倍視野下觀察海馬組織CA1區神經元排列、細胞形態變化及細胞核情況。

1.2.3.2 SP免疫組化法半定量檢測海馬腦片CA1區OTR、GABAAR β1表達 具體操作按照試劑盒說明書。SP法即鏈霉素抗生素蛋白－過氧化物酶連接法。石蠟切片依次經過二甲苯脫蠟、抗原修復后，行一抗+生物素標記二抗+辣根酶標記鏈酶卵白素+辣根酶底物DAB顯色。免疫組化染色陽性反應為細胞膜呈黃棕色。每張切片光鏡20×10倍下定位海馬CA1區，然后40×10倍下用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量CA1區陽性細胞的平均光密度值，分析OTR、GABAAR β1 的表達。

1.2.3.3 透射電鏡觀察 每組胎鼠各取2只，斷頭后立即取大鼠左側海馬組織2 mm×2 mm×5 mm，固定于3%戊二醛，1%鋨酸雙固定，Epon812樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。電鏡下觀察神經元、膠質細胞等超微結構改變。

1.3 統計學處理

用SPSS 11.5統計軟件包進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差表示，采用組間t檢驗及方差分析作統計學顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 蘇木素－伊紅染色結果比較

光學顯微鏡下，細胞核呈深藍色，胞漿呈淡紅色。實驗組腦片中可見海馬CA1區錐體細胞呈多層排列，結構清晰，細胞排列較整齊緊密、分布亦較均勻，神經細胞數目多、外形規則，細胞層可分3～5層，胞核圓形或橢圓形，染色較淡，染色質均勻，偶見核深染或固縮，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯。對照組腦片中可見海馬CA1區神經細胞層次變少，數量減少，排列紊亂、稀疏。部分神經細胞核深染、固縮，核仁不明顯，細胞周圍間隙增大。見圖1、2。

圖1 對照組錐體細胞形態 HE×400Fig 1 Morphology of cell in control group by HE staining×400

圖2 實驗組錐體細胞形態 HE×400Fig 2 Morphology of cell in experimental group by HE staining ×400

2.2 免疫組織化學染色結果比較

2.2.1 OT對胎鼠海馬腦片CA1區OTR表達的影響 實驗組與對照組胎鼠海馬腦片CA1區OTR免疫組織化學染色均有陽性反應，分別行平均光密度值測定，實驗組OTR表達的平均光密度值為(0.172±0.017)，與對照組(0.152 ±0.024)比較顯著升高(P=0.048 ＜0.05)，差異有統計學意義，見表1。

表1 海馬腦片CA1區OTR表達平均光密度值比較Tab 1 Comparison of integrated option density of OTR expression in CA1 areas of hippocampus

2.2.2 OT 對胎鼠海馬腦片 CA1 區 GABAAR β1 表達的影響 實驗組與對照組胎鼠海馬腦片CA1區GABAAR β1免疫組織化學染色均有陽性反應，分別行平均光密度值測定，實驗組GABAARβ1表達的平均光密度值為(0.142 ±0.018)，與對照組(0.124 ±0.020)比較顯著升高(P=0.036 ＜0.05)，差異有統計學意義，見表2。

表2 海馬腦片CA1區GABAAR β1表達平均光密度值比較Tab 2 Comparison of integrated option density of GABAAR β1 expression in CA1 areas of hippocampus

2.3 電鏡觀察海馬神經細胞的損傷情況

對照組大量神經元受損、變性、壞死，核固縮或碎裂，部分核膜溶解，染色質呈團塊狀凝集，核仁碎裂，胞質內細胞器明顯減少導致電子密度變低。其中細胞核超微結構改變見圖3。

實驗組細胞核、粗面內質網、線粒體均較對照組有所改善，核膜較光滑，染色質細小而分散，胞漿腫脹較對照組減輕，可見較多的細胞器。亦可見核膜皺褶內陷，核固縮，染色質凝集、邊集等凋亡現象。其中細胞核超微結構改變見圖4。

圖3 對照組海馬細胞電鏡下超微結構Fig 3 Ultralstructure of hippocampal cells in control group by transmission electron microscopy

圖4 實驗組海馬細胞電鏡下超微結構Fig 4 Ultralstructure of hippocampal cells in experimental group by transmission electron microscopy

3 討 論

胚胎中晚期及出生早期是海馬神經元發育成熟的關鍵時期，海馬結構中錐體細胞的產生、遷移、定位等均于胚胎時期完成。由于中樞神經系統對氧具有高敏感性，發育中的神經元對氧的需求較高。分娩過程對胎腦來說是具有高損傷風險的應激性事件，而這種應激主要來自產前、產時宮縮形成的相對缺氧狀態。因此，離體狀態下研究OT對孕晚期胎鼠海馬OGD是否有神經保護作用及作用機制具有重要意義。

3.1 OT及OTR系統

OT為9個氨基酸組成的多肽，在哺乳、分娩、應激等刺激下釋放入血液循環。OTR是經典G蛋白偶聯受體，當OT與OTR胞外區結合后，活化胞內區Gq亞單位后激活磷脂酶C－β進而產生一系列的生理功能［5］。本實驗中經OT預處理的胎鼠海馬腦片經OGD后，CA1區OTR較對照組顯著升高，上調了OTR在細胞膜上的表達。

3.2 GABA及GABAR系統

在成熟的大腦中GABA是重要的抑制性神經遞質，GABA 通過與其受體(gamma－aminobutyric acid receptor，GABAR)結合而發揮作用。GABAAR在神經系統廣泛分布，主要介導突觸后抑制效應，其中β1亞基是受體主要激活位點。在未成熟神經元，GABA是主要的興奮性神經遞質，對胎兒期和新生兒期神經元發育至關重要。當GABA與GABAAR結合，配體門控氯離子通道開放，神經元胞膜對Cl－通透性增加，Cl－流出神經元，神經元產生去極化效應，激活電壓依賴性Ca2+通道，從而使細胞內Ca2+濃度升高，對神經元的生長和分化發揮重要作用［6］。研究發現分娩時主要來源于母體下丘腦的OT通過胎盤屏障和胎兒血腦屏障到達胎兒大腦［7］，通過降低氯離子內向協同轉運體(Na+－K+－2Cl－cotransporter 1，NKCC1)的活性以減少Cl－的內源性轉運，使得神經元內 Cl－濃度下降［8］。本實驗中經OT預處理的胎鼠海馬腦片經OGD后，CA1區GABAAR β1較對照組顯著升高，上調了GABAARβ1在細胞膜上的表達。當GABA作用于GABAAR時，配體門控Cl－通道開放增加，Cl－順濃度差內流增加，GABA效應由興奮性向抑制性轉化。

3.3 OT 與 OTR、GABAAR β1 關系

缺血缺氧可直接導致海馬細胞損傷、能量衰竭。腦血流和氧運輸的減少啟動潛在有害生化級聯反應，包括葡萄糖氧化磷酸化中斷，細胞內ATP迅速耗竭，乳酸堆積、細胞膜去極化、興奮性氨基酸釋放以及細胞內Na+、Ca2+、水、自由基堆積，從而導致細胞毒性水腫和細胞死亡。本實驗海馬腦片石蠟切片HE染色、電鏡結果均提示，實驗組細胞的變性壞死明顯減少，OT對海馬神經元起保護作用。

本實驗研究結果顯示，經OT預處理的胎鼠海馬腦片 OGD后與對照組比較，OT顯著上調 OTR、GABAAR β1表達。OT可能通過一系列的下游機制抑制NKCC1活性，降低神經元內Cl－濃度，Cl－順濃度差內流增加，當GABA與GABAAR結合時，配體門控Cl－通道開放增加，GABA效應由興奮性向抑制性轉化，導致神經元去極化抑制，減少神經元的耗氧量，從而增強大腦耐受缺氧損傷的能力，減輕分娩中缺氧和低血糖等傷害事件對胎兒大腦的損傷，實現對胎兒神經系統的保護作用。

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