奧曲肽抑制人卵巢癌細胞增殖的研究

李煒虹，沈楊，張云霞，任慕蘭

(1.南京市市級機關醫院 婦科，江蘇 南京 210008;2.東南大學附屬中大醫院婦產科，江蘇 南京 210009)

生長抑素(somatostatin，SST)是一種環狀多肽類激素，由Brazeau等［1］于1973年從羊下丘腦中分離提取。現在認為SST對許多疾病如腫瘤、炎癥、糖尿病、癲癇、早老性癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈病以及艾滋病的發生、發展和防治具有重要意義［2］。奧曲肽(SMS-201995，OCT)為SST 8肽類似物，是第一個用于臨床的SST類似物，目前其主要用于肝癌、胃癌和胰腺癌的輔助治療。

1 材料和方法

1.1 材料

基礎培養液:RPMI 1640培養液，加入10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(上海華美公司):溶于D-Hanks液中配制成0.25%濃度;SST類似物OCT:由上海子能制藥有限公司合成;順鉑(cisplatin):山東齊魯制藥廠產品，4℃保存;人卵巢癌細胞株SKOV3:購自第四軍醫大學西京醫院婦產科實驗室，細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養，0.25%胰蛋白酶消化細胞成單細胞懸液;雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠:購自中國醫學科學院實驗動物研究所，體重18～22 g，SPF環境下飼養;兔抗人血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體:購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立 將SKOV3細胞制成單細胞懸液，以5×106個細胞·只－1接種于裸鼠右側腋窩靠近背部皮下，共接種20只。

1.2.2 藥物干預移植瘤 建模2周后將20只裸鼠隨機分成空白對照組、OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯用組4組，每組5只。空白對照組皮下注射生理鹽水100 μg·kg－1，1 次·d－1;OCT 組皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1;順鉑組分別于成瘤后第 1、8、15、22 日腹腔注射順鉑4 mg·kg－1;OCT與順鉑聯用組皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1，并于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射順鉑4 mg·kg－1。用藥4周后頸椎脫位法處死裸鼠，皮下剝離瘤體，稱取腫瘤重量，游標卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式V=ab2/2計算腫瘤體積。抑瘤率=(對照組瘤體積－實驗組瘤體積)/對照組瘤體積×100%。腫瘤標本分為兩份，1份置于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，常規脫水，透明，浸蠟，包埋，5 μm連續切片;另1份立即制成單細胞懸液行流式細胞分析。

1.2.3 病理學分析及免疫組織化學法檢測VEGF表達 腫瘤切片行常規蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察腫瘤細胞形態。免疫組織化學染色采用兩步法，結果判定以細胞漿呈清晰棕黃色為陽性，采用計算機圖像分析軟件Image-Pro plus 4.5對VEGF陽性部位進行原位定量檢測，每張切片隨機選取5個視野，自動選取陽性部位并計算平均光密度(IOD)值，計算5個視野的平均值作為該切片的代表值。

1.3 統計學處理

結果以均數±標準差表示，數據處理采用SPSS 11.5統計軟件，多組間比較采用方差分析，兩兩之間用q檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 OCT對裸鼠卵巢癌移植瘤生長的影響

20只裸鼠接種7 d后于接種部位皮下均可見直徑約2 mm的瘤塊，致瘤率為100%，用藥滿28 d時20只裸鼠均存活。處死裸鼠見腫瘤處皮膚表面無潰瘍結痂，腫瘤包膜完整，均可用手推動。OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯用組腫瘤重量及體積均明顯低于空白對照組，差異有統計學意義。各用藥組兩兩比較，腫瘤重量及體積無顯著性差異。見表1。

表1 各用藥組移植瘤重量及體積的變化Tab 1 Changes of tumor weight and volume in treated mice

2.2 病理學分析及免疫組織化學法檢測VEGF表達

腫瘤組織蘇木精-伊紅染色切片見腫瘤細胞大小不一，胞漿粉紅色，核圓形，腫瘤內可見血管結構。VEGF染色主要定位于腫瘤細胞胞漿，呈棕黃色，少數血管內皮細胞也見有陽性表達。各用藥組移植瘤組織中VEGF表達明顯下降，與空白對照組相比差異均有統計學意義(P＜0.001)，但各用藥組兩兩間比較差異無統計學意義(P=0.267)。見圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測各實驗組腫瘤組織VEGF的表達Fig 1 VEGF expressions on tumor was examined by immunohistochemistry

3 討 論

SST廣泛分布于大多數人體器官組織，具有抑制激素分泌、調節神經傳遞及細胞增殖的作用。已有研究證實卵巢癌中存在生長抑素受體(SSTR)的表達，如陳懷增等［3］采用RT-PCR方法證實卵巢癌細胞株SKOV3及3AO均表達Ⅱ型 SSTR(SSTR2)。Hall等［4］利用免疫組織化學方法對63例惡性卵巢腫瘤和35例良性卵巢腫瘤患者的SSTR表達進行了檢測，發現SSTR在腫瘤組織上皮、間質以及血管中均有不同程度的表達，在卵巢腫瘤組織血管壁的中膜平滑肌中亦可見SSTR的高表達。這些實驗提供了SST治療卵巢癌的可能性。

本實驗結果顯示在給予OCT、順鉑及兩藥聯合應用后，移植瘤重量及體積均明顯低于空白對照組，但各用藥組兩兩間比較抑瘤作用無顯著性差異，提示對于卵巢癌，非化療藥OCT可能具有相當于順鉑的抗腫瘤效果。順鉑是目前臨床治療卵巢癌患者的一線化療藥物，但其毒副反應較大且易產生耐藥，而肽類化合物OCT副反應小，可望用于對順鉑耐藥的卵巢癌患者。

腫瘤的血管生成是由腫瘤細胞分泌的各種促血管生成因子所誘發，其中VEGF是迄今為止發現的最重要的血管生成因子。它具有增加血管通透性、促進不同來源的內皮細胞分裂增殖和血管構建及促使內皮細胞遷移等多種作用，以VEGF作為抗腫瘤血管生成治療的理想靶點已逐漸成為國內外學者的共識。Osada等［5］的研究表明，VEGF高表達的卵巢癌患者生存率明顯低于VEGF低表達者。本實驗采用免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織內VEGF的表達，結果顯示各用藥組VEGF的表達較空白對照組明顯下降，提示OCT抗腫瘤作用機制之一為抑制腫瘤新生血管生成。

據文獻［6-10］報道SST及SSTA抗腫瘤作用的機制可能包括:(1)通過與SSTR結合直接抑制腫瘤細胞增殖;(2)抑制促腫瘤生長的激素或細胞因子的釋放;(3)抑制腫瘤血管生成;(4)誘導腫瘤細胞凋亡。

本實驗證實OCT對卵巢癌細胞株的抑制作用與傳統抗腫瘤藥順鉑相當，可為卵巢癌治療提供新途徑。

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［3］陳懷增，謝幸，葉大風，等.卵巢上皮性癌生長抑素受體2表達的研究［J］.中華婦產科雜志，2002，37(5):306-307.

［4］HALL G H，TURNBULL L W，RICHMOND I，et al.Localization of somatostatin and somatostatin receptors in bening and malignant ovarian tumors［J］.Br Cancer，2002，87(1):86-90.

［5］OSADA R，HORIUCHI A，KIKUCHI N，et al.Expression of semaphorins，vascular endothelial growth factor，and their common receptor neuropilins and alleic loss of semaphorin locus in epithelial ovarian neoplasms:increased ratio of vascular endothelial growth factor to semaphorin is a poor prognostic factor in ovarian carcinomas［J］.Hum Pathol，2006，37(11):1414-1425.

［6］HE Y，YUAN X M，LEI P，et al.The antiproliferative effects of somatostatin receptor subtype 2 in breast cancer cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(7):1053-1059.

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［10］GABRIEL M，ANDERGASSEN U，PUTZER D，et al.Individualized peptide-related-radionuclide-therapy concept using different radiolabelled somatostatin analogs in advanced cancer patients［J］.Q J Nucl Med Mol Imaging，2010，54(1):92-99.