131I-1H12的制備及對非小細胞肺癌細胞A549的結(jié)合及生物學效應研究

殷寧，杜明華，鐘英，曲海船

(東南大學附屬中大醫(yī)院核醫(yī)學科，江蘇南京 210009)

表皮生長因子受體(EGFR)在非小細胞肺癌的治療中已成為一個重要的靶點，目前針對EGFR的肺癌靶向治療藥物(易瑞沙、特洛凱等)早已進入臨床應用［1-2］。為研究應用抗EGFR抗體進行非小細胞肺癌放射免疫顯像及治療的可能性，本實驗通過放射性碘標記EGFR單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)1H12，探討了131I-1H12與人肺癌細胞A549在體外結(jié)合情況及其生物學效應。

1 材料與方法

1.1 A549細胞

人非小細胞肺癌A549細胞系22代，購于中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 主要儀器

FH463A自動定標器(西安二六二廠核儀器分廠);RM-905a活度計(中國計量科學研究所);HERA Cell CO2培養(yǎng)箱(美國Kendro公司);Eppendorf cenhifuge低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司);YJ-875超凈工作臺(蘇州蘇凈凈化設備有限公司);流式細胞儀:FACS Vantage SE型。

1.3 主要試劑

鼠抗人EGFR McAb(1H12):美國CST公司產(chǎn)品，純度＞98%。Na131I溶液:中國核動設計院第一研究所(無還原劑、無載體)產(chǎn)品。Iodogen(四氯二苯基甘脲):美國Sigma公司產(chǎn)品。葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50):瑞典Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液:Gibcobrl公司產(chǎn)品。胎牛血清(FCS):杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。

1.4 131I-1H12 的標記與鑒定［3］

(1)標記前準備:將Iodogen溶解于二氯甲烷中制成濃度為 1 μg·μl-1的 Iodogen 溶液，取 100 μl加入乙烯Eppendorf管中，氮氣吹干后在試管底部內(nèi)壁形成一層均勻的Iodogen膜，制備完成后保存于4℃?zhèn)溆谩?2)Iodogen法131I標記1H12:在涂布 Iodogen的 Eppendorf管中依次加入0.5 mol·L-1、pH 7.6 的磷酸鹽緩沖液 50 μl，1H12 25.0 μg(pH 7.6 PBS 溶解，濃度1 μg·μl-1)，Na131I 46.25 MBq，充分混勻后在室溫下反應10 min，其間溫和振蕩數(shù)次。(3)分離純化反應:將反應液滴加于預先經(jīng)PBS(0.01 mol·L-1、pH 7.4)平衡、2%牛血清白蛋白封閉飽和的SephadexG-50層析柱上，用0.01 mol·L-1、pH 7.4 的 PBS 洗脫層析柱，自動收集器收集部分洗脫液，流速每管1.0 ml·min-1，共收集20管，按收集時間順序排列各管;RM905放射性活度計測定各管的活度，以Rf為橫坐標，對應各管的放射性活度為縱坐標，制作時間-放射性活度洗脫曲線。(4)放射化學純度(radio chemical purity，RCP)測定:生理鹽水紙層析法測定標記物RCP。(5)計算標記率、放射濃度:標記率=蛋白峰各管放射性活度總和/蛋白峰加游離峰各管放射性活度之和;放射濃度=投入的Na131I總量×標記率/蛋白峰收集的總ml數(shù)。(6)比活度的測定:放射性比活度=投入的Na131I總量×標記率/投入的1H12量。(7)131I-1H12的體外穩(wěn)定性，置于室溫37℃，于第24小時、48小時、72天測定各自放射化學純度，評價其體外穩(wěn)定性。(8)131I-1H12收集液過濾除菌備用。

1.5 131I-1H12對A549細胞株的體外實驗

(1)A549細胞EGFR表達率:取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至106ml-1，用-20℃預冷的80 ml·L-1乙醇固定過夜，流式細胞測定EGFR的表達率。(2)131I-1H12免疫活性的鑒定:常規(guī)培養(yǎng)的肺癌細胞株(A549)、臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液制備細胞懸液調(diào)至細胞濃度1×106ml-1，兩種細胞分別裝入6孔培養(yǎng)板使細胞濃度在1×106細胞·(1.0 ml)-1·孔-1(足量)，每組細胞中分別加入131I-1H12(105 cpm)，搖勻，常規(guī)培養(yǎng)12 h，每2 h振蕩1次，培養(yǎng)12 h后將每孔的上清液移入試管，0.25 ml胰蛋白酶消化A549細胞與臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，將細胞移入裝有相應上清液的試管。在FH463A自動定標器上測定每孔的總放射性。1 000 r·min-1離心5 min，去上清液。沉淀用PBS洗滌3次，最后測沉淀物放射性。按如下公式計算體外細胞結(jié)合率:體外細胞結(jié)合率(%)=沉淀部分放射性計數(shù)(cpm)/總放射性計數(shù)(cpm)×100%［4］。(3)藥物實驗分組:將24瓶對數(shù)生長期A549細胞分成A～F 6組，每組4瓶，A、B、C組分別加入131I-1H12 148、74、37 kBq，D 組加入 Na131I溶液 148 kBq，E 組加入 1H12 80 nmol·L-1，F(xiàn) 組加入等量培養(yǎng)液［5］。(4)檢測131I-1H12對細胞的生物學作用:給藥后的各組細胞用小鉛磚分隔培養(yǎng)12 h后換液(普通培養(yǎng)液)，繼續(xù)分隔培養(yǎng)36 h。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，收集細胞以調(diào)整濃度至106ml-1，用-20℃預冷的80 ml·L-1乙醇固定過夜，并用以 AnnexinⅤ-FIFC/PI雙染法測定藥物對細胞的早期誘導凋亡作用，采用DNA 倍體分析法檢測細胞周期［4，6］。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，SPSS 13.0軟件處理，采用方差分析;兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR McAb131I-1H12的標記及鑒定

Iodogen法碘化標記McAb(1H12)，經(jīng)SephadexG-50柱層析分離游離碘和EGFR McAb131I-1H12，從洗脫曲線上(圖1)可見:131I-1H12蛋白峰出現(xiàn)在第3、4、5管;游離碘峰出現(xiàn)在第10、11、12管。標記產(chǎn)物進行紙層析，根據(jù)公式計算其標記率為50.14%，比活度為4.63 MBq·μg-1，其放射濃度為 77.31 MBq·ml-1，生理鹽水紙層析法測定放射性化學純度為96.92%。24、48、72 h我們測得的放射性化學純度依次為95.33%、94.79%和91.03%，說明標記產(chǎn)物在體外具有較好穩(wěn)定性。

圖1 洗脫曲線Fig 1 Elution curve

2.2 標記抗體131I-1H12的免疫活性

標記抗體經(jīng)體外細胞結(jié)合分析顯示131I-1H12與A549細胞體外結(jié)合率達61.12%，而與人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞不發(fā)生特異性體外結(jié)合，其結(jié)合率僅為7.16%，和前者比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。說明:(1)1H12經(jīng)131I Iodogen法標記后保持有良好的免疫結(jié)合特性。(2)131I-1H12與A549細胞呈特異性結(jié)合。

2.3 131I-1H12對A549細胞的生物學作用

流式細胞儀測得A549細胞的EGFR表達率為75%。光鏡下細胞形態(tài)改變［7］:倒置顯微鏡下見A、B、C組A549細胞不同程度變圓，胞體皺縮，細胞輪廓漸趨模糊，形態(tài)異常。有的細胞結(jié)構(gòu)松散，細胞質(zhì)粗糙，顆粒明顯增多，出現(xiàn)堆積現(xiàn)象，多數(shù)細胞脫壁，漂浮于培養(yǎng)液中。而F組細胞未見有上述現(xiàn)象，細胞生長旺盛，有很多分裂相(圖2)。流式細胞術(shù)分析各組細胞的細胞周期及凋亡(表1):通過亞G1峰檢測其凋亡率分別為A組(44.35±3.31)%、B組(16.29±2.76)%、C組(9.36±2.32)%、D組(8.03±1.38)%、E組(1.51±0.79)%、F組(1.44±0.34)%，各組與 F組比較，細胞凋亡率有統(tǒng)計學差異，A、B、C組的凋亡率隨放射性濃度增加而升高。細胞周期阻滯亦隨藥物劑量增加而升高，從(33.84±1.92)%升高至(51.17±2.98)%，呈明顯劑量效應關系(圖3、4)。A組與D組比較存在統(tǒng)計學差異，說明發(fā)揮腫瘤殺傷作用的是與細胞結(jié)合的131I-1H12。

圖2 倒置顯微鏡下A549細胞形態(tài)比較Fig 2 Comparison of A549 cell morphology under inverted microscope

表1 各組細胞周期及細胞凋亡率(±s) %Tab 1 Cell cycles analysis and apoptosis rates of different sub-groups(±s) %

表1 各組細胞周期及細胞凋亡率(±s) %Tab 1 Cell cycles analysis and apoptosis rates of different sub-groups(±s) %

與F組相比，a P＜0.01，b P＜0.05;未標記的表明無統(tǒng)計學差異

組別細胞周期G0/G1 S G2/M細胞凋亡率(subG1)A組 29.46±1.34a19.37±1.08 51.17±2.98a44.35±3.31a 57.77±2.77 29.69±2.98 22.54±1.18 1.44±0.34 B組35.37±2.12a21.41±1.33 43.22±1.73a16.29±2.76a C組40.03±3.69a26.13±3.12 33.84±1.92a9.36±2.32b D組37.32±0.92a31.50±2.03 31.18±1.09a8.03±1.38b E組 56.07±3.87 30.88±0.96 19.05±1.35 1.51±0.79 F組

圖3 各組細胞周期及凋亡柱狀圖Fig 3 Histogram of cell cycles and apoptosis of different sub-groups

圖4 各組凋亡圖示例Fig 4 Examples of each group's apoptosis diagram

3 討 論

鼠抗人EGFR McAb(1H12)系免疫球蛋白IgG，分子質(zhì)量為17.5 kDa，本實驗以Iodogen法對1H12進行131I標記，標記率為50.14%，放化純度＞95%，在體外穩(wěn)定性良好。抗體的同位素標記技術(shù)中最重要的是要保持抗體尤其是McAb的生物、免疫學活性，否則即使標記工作做得再好也無法將標記抗體應用于下一步的實驗或臨床領域。我們實驗結(jié)果證實抗EGFR McAb(1H12)經(jīng)碘化標記以后保持原有的免疫學活性，131I-1H12能與肺癌A549細胞發(fā)生特異性結(jié)合。

已有研究表明，細胞周期的阻滯與細胞凋亡、分化密切相關，細胞通過2個限制點(G0/S期和G2/M期限制點)保證細胞的復制［8］。細胞受損時，通過激活限制點分別導致細胞的G0期或G2期延遲，使細胞有時間完成復制前和有絲分裂前的修復，以保證細胞存活;當損傷超過細胞的修復能力時，則促使細胞凋亡。為探討131I-1H12對A549細胞的生物學效應，我們使用流式細胞術(shù)對各組A549細胞的細胞凋亡情況及細胞周期的變化進行了觀察。實驗結(jié)果表明，給藥48 h后A、B、C組A549細胞隨著藥物放射性活度增強，G0/G1期細胞逐漸減少，G2/M期細胞明顯增多，呈明顯劑量效應關系。凋亡率也由(9.36±2.32)%升至(44.35±3.31)%，說明A549細胞抑制作用可能與G2/M期阻滯有關。C組與D組的凋亡率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，說明小劑量長時間131I-1H12與大劑量短時間Na131I對A549細胞的凋亡作用相當。

有研究表明大多數(shù)非小細胞肺癌細胞EGFR能夠高密度表達和(或)發(fā)生突變，而正常人肺組織EGFR表達呈陰性［1］。目前以肺癌EGFR為靶點的腫瘤靶向治療方法較多，很多靶向藥物已經(jīng)開始應用于臨床。我們選用高敏感性鼠抗人EGFR McAb(1H12)做了放射性碘標記的實驗，并探討了標記后的131I-1H12對EGFR表達陽性(75%)的A549細胞的生物學效應，為體內(nèi)進行非小細胞肺癌EGFR為靶點的放射免疫顯像及治療奠定實驗基礎［9-10］。與以往單純的抗肺癌單克隆抗體介導的放射免疫治療相比［11-12］，131I-1H12并不僅僅作為非小細胞肺癌的靶向治療藥，只要是高表達EGFR的腫瘤都能適用，且運用低劑量131I-1H12進行腫瘤EGFR的放射免疫顯像，可作為其他針對EGFR的靶向治療初篩條件［2］，從而減少不必要的醫(yī)療資源消耗。雖然運用表皮生長因子(EGF)作為核素的載體，同樣可以達到對腫瘤的EGFR靶向治療的效果［13］，考慮到EGF本身作為促進腫瘤生長的因素之一，其作為放射性核素載體在實際的臨床應用的安全性仍將受到質(zhì)疑。綜上所述，無論用放射免疫顯像進行腫瘤表達EGFR與否的分類和初篩，還是本身作為靶向治療劑，放射性核素標記EGFR單克隆抗體都具有潛在而可觀的應用前景［14-15］。

關于131I-EGFR McAb對體內(nèi)非小細胞肺癌的相關實驗，筆者將在接下來的工作中繼續(xù)深入研究。相信隨著研究的不斷深入，必將使非小細胞肺癌的此類靶向診斷及治療模式逐漸趨于完善。

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