HPLC法測定德歐血脂平膠囊中薯蕷皂苷元的含量

王繼彥,位 鴻,王 蔚,高紅梅,關樹光,王 沛

(長春中醫藥大學,吉林長春130117)

高血脂和動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發生的生化和病理學基礎,因此,降血脂和抗動脈粥樣硬化癥藥物的研究一直受到人們的重視。天然甾體化合物具有降血脂作用已有報道[1-2]。德歐血脂平膠囊是以從薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino根莖中提取的有效成分薯蕷皂苷元(diosgenin)為原料制成的中藥一類膠囊制劑,具祛痰降濁,活血通絡等功效。臨床用于高脂血癥、動脈粥樣硬化癥的治療。筆者在新藥開發研制過程中,為了有效的控制原料及成品質量,建立了有效成分薯蕷皂苷元的高效液相色譜測定方法。

1 儀器與材料

日本SHIMADZU LC-10AT高效液相色譜,RID-10A示差檢測器(RIU/FS=1×10-6),WDL-95色譜工作站。甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。薯蕷皂苷元對照品購自美國SIGMA公司,批號101H7711,純度為98.68%。德歐血脂平膠囊成品由長春中醫藥大學附屬醫院新藥研究中心提供。

2 方法與結果

2.1 色譜分析條件 色譜柱:LUNA SILICA(4.6 mm ×150 mm,5 μ m,Phenomenex公司),流動相:正己烷-醋酸乙酯(88∶12);體積流量:1.0 mL/min;柱溫: 25℃;檢測器:RID-10A示差檢測器(RIU/FS=1× 10-6)。

2.2 對照品溶液的制備 取經80℃干燥至恒重的薯蕷皂苷元對照品約250 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,加氯仿稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL中約含薯蕷皂苷元10 mg)。

2.3 原料藥供試品溶液的制備 精密稱取經80℃干燥至恒重的本品適量,加氯仿溶解并稀釋制成每1 mL中約含本品10 mg的溶液,搖勻,即得。

2.4 制劑供試品溶液的制備 取本品裝量差異項下的內容物,混合均勻,經80℃干燥至恒重后,精密稱取適量,加氯仿溶解并稀釋制成每1 mL中約含本品10 mg的溶液,搖勻,即得。

2.5 線性關系的考察 精密稱取經80℃干燥至恒重的薯蕷皂苷元對照品500 mg,置50 mL量瓶中,加氯仿稀釋至刻度,精密吸取對照品溶液1.25,2.50, 3.75,5.00,6.25,7.50,10.00 mL分別置10 mL量瓶中,加氯仿稀釋至刻度。按上述色譜條件各進樣20 μ L測定峰面積,以進樣量對相應峰面積進行線性回歸,計算得回歸方程:Y=404 9X-3.526×103,r= 0.999 8。表明薯蕷皂苷元在25～200 μ g范圍內有良好的線性關系。

2.6 穩定性試驗 取供試品溶液,分別于0,2,4,6, 8,10 h進樣,計錄峰面積。結果供試品峰面積 RSD為1.17%(n=6)。表明供試品溶液在10 h內穩定。2.7 精密度試驗 取供試品溶液,連續進樣6次測定,結果峰面積RSD為1.0%(n=6)。

2.8 重現性試驗 取同一批樣品(批號980210)6份,制備供試品溶液,依上述方法進行6次測定,結果薯蕷皂苷元質量分數的RSD為0.65%(n=6)。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法。精密稱取已知薯蕷皂苷元含量為94.11%(6次測定平均值)的原料藥(批號980210)5份,每份約100 mg,分別精密添加約100 mg的薯蕷皂苷元對照品,同樣方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進樣,測定峰面積,計算回收率。結果薯蕷皂苷元的平均回收率為 101.2%, RSD=1.9(n=6)。

2.10 樣品測定 取原料藥薯蕷皂苷元及德歐血脂平膠囊成品(6批),分別制備原料藥及成品供試品溶液,按上述色譜條件進行分析,根據外標法測定計算薯蕷皂苷元的含量(圖略)。6批原料藥中薯蕷皂苷元的質量分數分別為 0.927,0.942,0.926,0.959, 0.941,0.960 g/g;6批成品中薯蕷皂苷元的含量分別為198.1,198.0,202.6,205.5,205.4,202.6 mg/粒(標示含量分別為99.1%,99.0%,101.3%,102.8%, 102.7%,101.3%)。

3 討論

3.1 供試品溶液制備的溶劑選擇 由于本制劑屬于中藥新藥分類一類藥,為單體化合物,考慮到在含量測定時對雜質的控制,對樣品的溶解度進行了測定試驗。按《中國藥典》2005年版一部凡例的標準規定所要求的方法對樣品和薯蕷皂甙元對照品進行了溶解測定,通過用氯仿、苯、醋酸乙酯、乙醇、甲醇等試劑溶解進行比較,結果用氯仿溶解的效果最佳。

3.2 色譜條件的選擇 本測定方法采用的色譜條件是根據上述樣品的溶解性并在參考文獻的基礎上經實驗改進后所確定。薯蕷皂苷元分子結構中雖然有一雙鍵,但僅在紫外末端有弱的吸收,文獻報道有采用示差檢測器[3]或紫外、ELSD法等檢測器[4-6]進行檢測,根據本制劑的具體情況,經比較實驗采用了示差檢測器;經比較了多種色譜柱后選擇了硅膠柱;流動相為[石油醚(b.p.60～80℃)-異丙醇(12∶1)]?？紤]到石油醚為混合物具不穩定性,因而沒有采用文獻的流動相。試驗中曾以正己烷-異丙醇(98∶2);正己烷-醋酸乙酯(80∶20)等條件進行試驗,但結果以正己烷-醋酸乙酯(88∶12)為佳。

3.3 測定結果 本方法簡便快速,結果準確可靠,可為德歐血脂平膠囊的質量控制及薯蕷皂苷元的含量測定提供可行的方法。

[1]Cayen MN,Ferdinandi ES,Greselin E,et al.Studies on the disposition of diosgenin in rats,dogs,monkeys and man[J]. Atherosclerosis,1979,33:71.

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[3]S.B.Mahato,N.P.Sahu,S.K.roy,et al.High-performance liquid chromatographic method for the determination of diosgenin in plants[J].Journal of Chromatography,1981,206:169-173.

[4]沈娟,武向峰,朱臻宇,等.RP-HPLC法測定金剛藤軟膠囊中薯蕷皂苷元的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2005,16 (6):438-440.

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[6]付輝政,萬凱化,劉敏.HPLC-ELSD法測定抗病毒分散片中薯蕷皂苷元的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(5): 380-381.