總黃酮類化合物含量測定方法和藥理作用研究進展

田永利 許志宇 葛林 劉娜

總黃酮類化合物是廣泛地存在于植物中的一類化合物，目前已有近萬種總黃酮被鑒定，植物經光合作用產生的一大類低分子量天然物質，在蔬菜、作物、水果等植物中均有分布，此類化合物具有具有保護心腦血管、利膽保肝、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過敏、抗炎癥、抗病毒等多種生物活性及藥理作用。不少總黃酮化合物同時還存在多種功效。

1 總黃酮含量測定

中藥成分復雜，總黃酮化合物生物活性及藥理作用顯著，種類繁多，為了明確哪類中藥總黃酮含量較高，總黃酮含量測定成為重要方法。選擇適當檢測方法測量總黃酮含量，有利于提高藥物分析準確性。

1.1 紫外可見分光光度法 嚴贊開［1］綜述了紫外分光光度法測定植物中黃酮含量的方法.重點介紹了單波長法、差示法、雙波長法、三波長法、導數法等紫外分光光度法測定黃酮類化合物含量的原理及分析特性。

1.1.1 紫外可見分光光度法:是以分子吸收光譜為基礎的紫外－可見分光光度法，利用某些物質的分子在峰帶I(300～400 nm)和峰帶Ⅱ(220～280 nm)光譜區的吸光度來進行分析測定的方法。具有簡便、適用性廣、準確度、精密度和重現性較好等特點，在總黃酮含量分析中發揮著重要作用。

1.1.2 比色法:是一些藥典最常用的總黃酮含量檢測方法，它主要以Al(NO3)3為顯色劑，在堿性條件下，利用其與總黃酮形成紅色螯合物為特征。常用于總黃酮類化合物含量測定的金屬鹽試劑有Al(NO3)3、AlCl3等。

1.1.3 差示分光光度法簡稱ΔA法:使用稍高于樣品或稍低于樣品的標準作參比，測量樣品和參比間的相對吸光度。而此相對吸光度又與樣品和參比間的濃度差成比例關系，借差示工作曲線而求出樣品的含量。

1.1.4 雙波長和導數分光光度法:用于測定吸收光譜曲線重達的混合物的含量而不須用解聯立方程，還可分析高濃度及混濁樣品，其靈敏度和準確度比普通分光光度法好。在選擇波長時，原則上除了要干擾物有相等吸光度外，還要求兩波長比較接近，被測組分在該兩波長處的摩爾吸收系數相差大些，這樣方法的靈敏度會更高。如果將上述雙波長分光光度計上兩個波長盡可能指近，使只相差1～2 nm，并且同時進行掃瞄，能得到試樣一階導數吸收光譜-吸光度對波長的變化率曲線，即導數分光光度法。

1.2 色譜測定方法 陳叢瑾等［2］綜述了黃酮類化合物含量的色譜測定方法，包括薄層掃描法、高效液相色譜、超臨界流體色譜等，旨在為黃酮類化合物的研究、開發、應用提供參考。

1.2.1 薄層掃描法(TLCS):亦稱薄層光密度法(TLC-Densitometry)，是薄層色譜技術與光密度計和微型電子計算機結合起來的一種新型儀器分析方法。樣品經薄層分離后直接測定或經適當處理后使之顯色或產生熒光，在特定波長下用光度計測定其吸光度或熒光強度的方法。具有快速、簡便、專屬性好。同時可測定多個樣品的特點，廣泛的應用在中藥及其制劑的研究中，進行中藥的成分研究和含量測定。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC):是在液相色譜的基礎上引入氣相色譜的理論和技術，并加以改進而發展起來的一種重要的分離分析方法。具有分離效能高，分析速度快，靈敏度高等特點。電化學檢測器提高了高效液相的檢測的靈敏度和準確度，而且可以連續檢測中藥中的多種總黃酮成分。

1.2.3 超臨界流體色譜法 (supercritical fluid chromatography，SFC法):近年來出現的一種新方法，在分析領域得到應用，該法在國際上發展很快，但在我國還處于探索階段。

1.3 毛細管電泳法 是以電場驅動離子或荷電粒子，在毛細管中按其淌度或分配系數不同進行高效、快速的電泳分離新技術。常用的方法主要有毛細管區帶電泳(CZE)、膠束電動力學毛細管色譜(MEKC)、毛細管凝膠電(CGE)、毛細管等速電泳(CITP)等。操作模式中特別是CZE和MEKC都能很好的用于中藥成分含量分析。具有柱效高、分離速率快、樣品用量少，適用于“臟樣品”分析等特點。

1.4 熒光分光光度法 利用黃酮類化合物與某些金屬離子的絡合物在紫外線照射下可產生熒光，在一定條件下，熒光強度與該物質的濃度成正比的性質可建立黃酮類化合物的熒光光度法。總黃酮化合物的熒光光度測定法尚不多見，桑色素用于鈹的熒光光度測定有很高靈敏度，常被用作黃酮類化合物熒光光度測定法的標準［3］。隨著學科的深入發展，共振散射光譜法、單掃示波極譜法也逐漸應用于總黃酮的含量測定。

2 藥理作用

2.1 鎮痛作用 趙鐵華等［4］研究結果顯示灌胃、腹腔注射、皮下注射適宜劑量的黃芩莖葉總黃酮，對實驗動物經化學和熱刺激導致的疼痛反應皆有一定的抑制作用，其鎮痛作用機制與中樞作用相關。銀杏總黃酮(TFG)腹腔內注射可顯著抑制甲醛致小鼠疼痛反應，延長小鼠舔足潛伏期并減少小鼠扭體反應數。

2.2 對心血管系統的作用

2.2.1 對抗心肌損傷的保護作用:李樂等［5］研究發現絞股藍總黃酮能減輕犬心肌梗死時的心肌缺血程度，降低缺血范圍和心肌酶學指標的活性，可保護缺血心肌。廣棗總黃酮(TFCA)對阿霉素(ADR)引起大鼠心肌過氧化損傷具有保護作用。水杉總黃酮可在不明顯降低血壓的情況下，防止腎性高血壓大鼠左心室肥厚的發生。銀杏葉總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注血管內皮損傷有保護作用，對抗心肌缺血所引起的心肌電生理的變化，從而預防心肌缺血所致的心律失常的發生。蒲黃總黃酮對實驗性心肌缺血犬心肌具有保護作用［6］。黃蜀葵花總黃酮藥理性預適應可通過抑制心肌脂質過氧化、抑制心肌炎癥反應，對缺血;再灌注損傷的心肌具有保護作用;顯著降低心腦組織中丙二醛和NO含量，提示黃蜀葵花總黃酮對心腦缺氧有顯著保護作用;對小鼠急性心肌缺血、缺氧損傷具有保護作用［7］。

2.2.2 抗心率失常作用:苦參總黃酮能明顯對抗烏頭堿、哇巴因及氯仿誘發的心率失常。黃芩莖葉總黃酮對實驗性心率失常有顯著拮抗作用。

2.2.3 降血脂:銀杏葉總黃酮具有降低甘油三酯和膽固醇，升高高密度脂蛋白膽固醇和降低低密度膽固醇的作用。抗動脈粥樣硬化作用實驗顯示麥胚總黃酮類提取物(FEWG)能顯著提高實驗性高脂血癥大鼠血高密度脂蛋白膽固醇含量，同時顯著降低血清總膽固醇和三酰甘油含量［6］。蕎麥種子總黃酮能抑制喂飼固醇和高脂食物大鼠血清總膽固醇和三酰甘油的升高，抑制肝臟脂質過氧化。山楂總黃酮對氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導的人內皮細胞損傷具有顯著的拮抗作用，對氧化型低密度脂蛋白促MC-EC黏附作用有顯著的抑制性，降低動脈粥樣硬化發生的危險性，起到預防動脈粥樣硬化發生發展的作用。

2.2.4 抗高血壓、血管壁擴張作用:銀杏葉總黃酮其對血管緊張素轉化酶活性具有明顯的抑制作用。并對輕、中、重度妊娠高血壓患者的血壓均有下降，內皮素活性及NO含量降低，尿蛋白減少［8］。淫羊藿總黃酮對大鼠血清中內皮素有抑制作用，一氧化碳含量明顯降低，提示淫羊藿總黃酮擴張血管。

2.3 抗凝血作用 銀杏黃酮、蚓激素酶均具有很好的抗凝作用，但凝激酶溶栓效果優于銀杏黃酮，兩者合用后溶血作用無加強，但具有較好的抗凝效果［9］。水杉總黃酮有抗血小板聚集活性，改善血液流變性的作用，穿心蓮黃酮可明顯抑制二磷酸腺苷，花生四烯酸和腎上腺素誘導的血小板聚集，明顯降低凝血酶誘導的GMP-140水平，抑制AA誘導的血小板TXB2的釋放，并可明顯升高血小板內cAMP的含量。

2.4 利膽及肝臟保護作用 各種黃酮類化合物對化學性肝損傷、藥物性肝損傷、免疫性肝損傷、酒精性肝損傷、缺血/再灌注性肝損傷等實驗性肝損傷均有不同程度的保護作用［10］。知母總黃酮對溴酸鉀誘發的小鼠肝損傷具有一定的保護作用，可以明顯降低因溴酸鉀引起的小鼠血漿丙氨酸氨基轉移酶水平，保護因溴酸鉀誘發的肝損傷其作用機制可能部分來自于清除自由基和抑制脂質過氧化過程［11］。苦菜總黃酮對四氯化碳、乙醇所致肝損傷有明顯保護作用，提示可能與苦菜總黃酮減少肝臟谷胱甘肽耗竭，抑制肝脂質過氧化作用有關。

2.5 抗氧化、清除氧自由基作用 黃欣等［12］研究發現枸杞總黃酮能明顯延長小鼠力竭游泳運動時間，抑制丙二醛的產生及提高小鼠體內抗氧化酶活性，說明枸杞總黃酮具有提高小鼠運動耐力及清除活性氧的作用。苦蕎麥麩皮類黃酮與天然超氧化物歧化酶在清除氧自由基方面有著相同的作用一枝蒿總黃酮對的作用表現高濃度清除，低濃度增強的雙向作用;對(·OH)自由基的作用始終表現為濃度依賴性地清除作用，而且清除作用很強［13］。另有研究發現竹葉的總黃酮含量及其清除活性氧自由基的能力均與銀杏葉具有可比性。黃芪總黃酮在實驗中對(·OH)及(O2)均有較強的清除作用，且清除能力與濃度呈明顯的顯效關系。

2.6 抗腫瘤作用 黃酮類化合物抗腫瘤作用的靶點包括細胞周期蛋白依賴性激酶、硫氧還蛋白還原酶、基質金屬蛋白酶、絲裂原激活的蛋白激酶等。腫瘤細胞凋亡研究依據:(1)黃酮類化合物抑制細胞增殖，主要是使細胞周期停止，對腫瘤細胞有細胞毒作用，而對正常細胞無毒性和致突變作用，反而有抗氧化和正向的免疫調節作用;(2)黃酮類化合物促進腫瘤細胞凋亡;(3)黃酮類化合物能抑制細胞信號轉導過程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3激酶活性;(4)黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化壓力和促進抑癌基因表達而抑制癌基因表達的作用。漢黃芩素是從中藥黃芩中提取分離得到的一個化合物，研究表明其能促進鬼臼毒甙誘導的HL260、Jurkat和肺癌細胞的凋亡。芫花根總黃酮對小鼠S180腫瘤生長有顯著的抑制作用，其抗腫瘤活性是通過選擇性殺死腫瘤細胞和提高外周血淋巴細胞數量、促進淋巴細胞的增殖和提高NK細胞的殺傷活性來實現的［14］。木犀草素具有很強的誘導肝癌細胞凋亡活性。

2.7 對腦血管疾病的作用 李曉紅等［15］銀杏葉總黃酮對局部缺血再灌注腦組織中NR1mRNA的表達增強，與細胞凋亡密切相關，銀杏葉制劑可以明顯抑制NR1mRNA的表達，減輕細胞凋亡。文繼月等［16］黃蜀葵花總黃酮預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷具有缺血預適應樣的保護作用;其機制可能與促進NO合成及抑制前列腺素E2產生有關。山楂葉總黃酮可抑制腦缺血再灌注后神經細胞凋亡，其機制可能與抑制線粒體細胞色素C通路的凋亡有關［8］。

2.8 其他

2.8.1 對神經系統的作用:黃酮對M-膽堿能抑制樟柳堿所致小鼠腦記憶獲得障礙、蛋白生物合成抑制劑環己酰亞胺致小鼠腦記憶鞏固障礙、中樞抑制劑乙醇致小鼠腦記憶再現障礙、小鼠腦缺血再灌注致學習記憶功能障礙，均有明顯的改善作用，能顯著提高小鼠的近期記憶和長期記憶功能。

2.8.2 延緩衰老作用:淫羊藿總黃酮對于皮質酮大鼠T細胞過度凋亡均有明顯下調作用，并能對促凋亡及抗凋亡基因群進行適度地調控。蜂膠黃酮既能明顯提高腦組織抗氧化酶的活性，又同時顯著降低腦組織NO含量，提示蜂膠黃酮可以抑制NO的細胞毒作用，達到延緩衰老之目的。

2.8.3 對骨科方面的作用:淫羊藿總黃酮具有促進體外成骨細胞增殖及分化成熟的作用，還可提高去勢大鼠骨密度，對骨質疏松起防治作用。杜仲總黃酮能直接促進體外成骨細胞的增殖。野菊花總黃酮可恢復大鼠滑膜細胞具分泌功能細胞器形態，降低滑膜細胞分泌炎性介質的功能。

2.8.4 對免疫方面的作用:淫羊藿總黃酮對免疫功能低下小鼠有良好免疫促進作用。黃芩莖葉總黃酮對小鼠的特異性和非特異性免疫功能皆有一定的影響。

2.8.5 改善腎功能作用:黃蜀葵花抑制腎內髓ATP酶活性，從而減少腎小管對鈉的重吸收，發揮利鈉利水效應。

2.8.6 抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)作用:黃蜀葵花總黃酮中提取的金絲桃苷在體內外均有抗HBV的作用，且呈劑量依賴性。

2.8.7 修復口腔黏膜作用:黃蜀葵花中的多種黃酮類成分具有抑菌、鎮痛及抗炎消腫的作用，能治療口腔潰瘍，對疼痛也有較好的緩解作用。沙棘葉總黃酮對細菌有較強的抑制作用，在相同時間內，總黃酮提取液的濃度越大，抑菌率越大。同一濃度的沙棘葉總黃酮的作用時間越長，其抑菌率也越大［17］。

1 嚴贊開.紫外分光光度法測定植物黃酮含量的方法.食品研究與開發，2007，28:164-165.

2 陳叢瑾，黃克瀛，韋龍賓.色譜方法在植物黃酮含量測定中的應用.光譜實驗室，2007，24:821-824.

3 馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測定方法.安徽醫藥，2007，11:1030-1032.

4 趙鐵華，鄧淑華，石艷華，等.黃芩莖葉總黃酮鎮痛作用的實驗研究.中國中醫藥科技，2001，12:23.

5 李樂，孫曉東，高小利，等.絞股藍總黃酮對犬急性缺血心肌的保護作用.中國病理生理雜志，2008，24:388-389.

6 章紅燕，侯桂蘭，何福根.銀杏葉總黃酮和銀杏內酯對心腦血管作用的研究進展.浙江臨床醫學，2008，10543.

7 范麗，袁麗萍，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮對小鼠急性心肌缺血缺氧損傷的保護作用.中國藥房，2005，16:176.

8 紀影實，曲極冰，李紅等.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的保護作用.吉林大學學報(醫學版)，2008，34:590-592.

9 陳健康，王雷，李珂，等.銀杏黃酮與蚓激酶的抗凝溶栓作用.心臟雜志，2001，13:3081.

10 郭菁菁，楊秀芬.黃酮類化合物對動物實驗性肝損傷保護作用的研究進展.中國藥理學通報，2008，24:5-10.

11 李滿妹，江濤，黃杰昌.知母總黃酮對溴酸鉀誘發小鼠肝損傷的保護作用.中草藥，2008，39:252-253.

12 黃欣，趙海龍.枸杞總黃酮對運動小鼠腓腸肌抗氧化能力的影響.現代中西醫結合雜志，2008，17:2280-2281.

13 吳冰，徐貴發，趙秀蘭，等.麥胚黃酮提取物對荷瘤大鼠的抗氧化作用.衛生研究，2001，30:2151.

14 魏志文，高曉雯，鄭維發.芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究.解放軍藥學學報，2008，24:116-120.

15 李曉紅，張峰，趙明霞，等.銀杏葉制劑對大鼠腦缺血再灌注后N-甲基-D-天冬氨酸受體表達的影響及腦保護作用.神經科學通報，2005，21:210-213.

16 文繼月，陳志武.黃蜀葵花總黃酮預處理對大鼠腦缺血再灌注性損傷的保護作用.安徽醫科大學學報，2006，41:667.

17 張益娜，翁琴.沙棘葉總黃酮的抑菌性研究.農產品加工·學刊，2008，25:25-27.