Hepcidin在酒精性肝病發病中的作用研究進展

冀 楊 徐有青 王 晨

鐵作為人體最豐富的必需微量元素之一，廣泛參與體內各項生理活動，在紅細胞生成、DNA合成及細胞呼吸中均起著重要的作用。但是過量的鐵可催化過氧化物和超氧化物（O2-）成為氧化性更強的羥自由基（OH-）、高鐵自由基或超高鐵自由基，加重氧化應激及脂質過氧化反應，造成細胞損傷[1]。在正常情況下，機體嚴格調節鐵的吸收和利用以保持體內鐵穩態（iron homeostaisis）。鐵調節蛋白（Hepcidin）就是這樣一個由肝臟分泌，通過調節十二指腸、脾臟及骨髓中鐵轉運以維持鐵穩態的鐵調蛋白。在人體內，肝臟和網狀內皮系統是鐵儲存的主要場所，肝臟鐵沉積在很多肝臟疾病中普遍存在，而鐵代謝紊亂在這些疾病發展中起著推波助瀾的作用。酒精性肝病患者常伴有鐵代謝相關蛋白表達異常，出現轉鐵蛋白飽和度和鐵蛋白增高及肝臟鐵沉積。酒精和鐵呈協同作用加重肝臟損傷。目前研究認為酒精抑制鐵調節蛋白在肝臟表達可能是酒精性肝病“二次打擊”假說的一個發病機制。

一、酒精性肝病與鐵沉積

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是指由于過量酒精攝入導致的肝臟損害及其一系列病變，包括輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[2]。早期研究發現酒精與機體鐵代謝紊亂相關。肝細胞吸收鐵的方式可分為轉鐵蛋白（transferrin，Tf）和非轉鐵蛋白途徑。大部分血清鐵首先與Tf結合，再通過轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）被肝細胞吸收。而非結合鐵（non-Tf-bound iron，NTBI）的吸收則通過二價金屬離子轉運蛋白（divalent metal transporter，DMT1）。肝細胞膜上有兩種轉鐵蛋白受體（TfR），TfR1和TfR2。TfR2介導的鐵攝取是肝細胞獲得鐵的主要途徑。在正常肝臟細胞中TfR2呈穩定表達，而TfR1生成則受到抑制。Suzuki觀察到ALD患者肝臟組織中TfR1表達增加了80%，而正常組織中則沒有變化[3]。體外實驗也發現酒精和鐵處理后的大鼠肝臟細胞中TfR1表達顯著增加[4]，從而證實酒精可以影響TfR1表達和鐵吸收。臨床上有超過30%的ALD患者表現為血清鐵蛋白和轉鐵蛋白飽和度增高，肝臟內出現鐵的過度沉積[5]。在ALD早期階段僅在肝臟細胞內出現輕微的鐵沉積，當發展到酒精性肝硬化晚期，肝臟細胞及巨噬細胞中均會出現顯著的鐵沉積。同樣在ALD患者中還發現小腸及肝臟鐵攝取率較普通人增加[6，7]。酒精性肝硬化患者的血清鐵蛋白含量增高，其死亡率與肝臟鐵含量及鐵蛋白有關[8]。美國一項大規模人群調查也發現輕或中度飲酒即可提高鐵沉積的風險，而大量攝入酒精（每日飲用酒精飲品超過2瓶）后該作用更加明顯[9]。鐵沉積同樣存在于ALD動物模型[10]。但也有研究發現長期酗酒可致患者貧血和缺鐵，究其原因為飲食減少、消化吸收障礙或者胃腸道出血所致，向酗酒者提供全面和充分的營養后則不會發生，同時在營養良好的酒精性肝病患者中也不存在貧血和缺鐵情況[11]，均證明酒精本身不會引起鐵缺乏。目前我國尚缺乏酒精性肝病的全國性大規模流行病學調查資料。

酒精在肝臟經過細胞色素P450酶、乙醇脫氫酶、過氧化物酶代謝后產生超氧陰離子和自由基，誘發氧化應激和脂質過氧化反應；鐵作為一種強力催化劑，也能促進氧自由基的產生。當二者產生協同作用時，則加劇這一反應過程，造成肝臟損傷。肝臟中鐵沉積程度與脂質過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 4-羥基壬烯醛（4-Hydroxynonenal，4-HNE）水平呈正相關驗證了此觀點[12，13]。同時巨噬細胞中鐵含量升高會引起轉錄因子如細胞核因子（nuclear factor-kappa，NF-κB）活性和促炎因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素 1（interleukin-1，IL-1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）表達增加。這些脂質過氧化反應產物通過刺激肝細胞膠原的合成，促進肝纖維化，加速發展為肝硬化。另外，體內高鐵環境對腫瘤還有誘發和促進作用。有報道稱鐵超載可引起肝細胞腫瘤。而口服鐵螯合劑治療可以減輕慢性酒精性肝病大鼠的脂質過氧化損傷。

二、鐵代謝和鐵調節蛋白

在正常情況下，食物中的三價鐵首先在小腸粘膜上皮中的十二指腸細胞色素 b（duodenal cytochrome b，Dcytb）作用還原成二價鐵，然后由二價金屬離子轉運蛋白（divalent metal transporter1，DMT1）轉運進入腸上皮細胞。再經腸上皮細胞基底膜側的膜鐵轉運蛋白（ferroportin1，FP1）和膜鐵轉運輔助蛋白（hephaestin，HP）作用將二價鐵轉運入血并氧化為三價，轉鐵蛋白（transferrin）可與之結合，通過血液運送到全身各處。骨髓是機體利用鐵的主要部位，它通過網織紅細胞轉鐵蛋白受體攝取鐵后合成紅細胞及血紅素。網狀內皮系統中的巨噬細胞通過吞噬衰老紅細胞獲取鐵，亦可通過膜表面的TfR直接從循環系統中攝取鐵，保證鐵再循環。巨噬細胞中的鐵可以在銅藍蛋白作用下氧化后釋放到血漿供其他組織利用，也可以儲存在細胞內。在生理狀態下機體缺乏鐵排泄的機制，因此鐵穩態的維持顯得尤為重要。

研究發現近段小腸中存在一種稱為十二指腸隱窩細胞（duodenal crypt cells）的小腸上皮前體細胞，它能夠通過感受自身鐵含量又稱鐵池（iron pool）變化調控鐵調節蛋白（iron regulatory protein，IRPs）活性。當循環鐵水平升高，隱窩細胞內鐵池增大，抑制腸上皮細胞膜中DMT1和FP1等表達，減少鐵吸收。反之，循環鐵降低引起隱窩細胞內鐵池變小，鐵轉運蛋白表達量升高，鐵攝入量增加。但是鐵代謝信號在小腸、肝臟、骨髓和巨噬細胞之間傳遞的機制還不清楚。因此，推測存在一種廣泛分布體內的可溶性蛋白作為鐵代謝調節信號的傳遞者。

2000年Krause等[14]從血液中分離到一個富含半胱氨酸的抗菌多肽，后被證明就是一種鐵代謝調節激素，稱為肝臟表達的抗菌多肽-1（liver-expressed antimicrobial peptide-1，LEAP-1）。2001年Park等人[15]從人尿中也分離到這一多肽，命名為 Hepcidin，或 HAMP（hepcidin antimicrobial peptide）。它是由一個富含精氨酸和賴氨酸的84個氨基酸多肽，經加工剪切后成為20、22和25個氨基酸三種成熟形式的多肽，其中以Hepcidin25生物活性最強。Hepcidin廣泛存在于血液及其它體液并在肝臟特異性表達，心臟、肺及脊髓中也有少量表達，而其他臟器幾乎沒有表達。鐵調節蛋白的結構在不同物種間高度保守。小鼠體內存在兩個Hepcidin基因，分別為Hepcl和Hepc2。它們與人類Hepcidin基因的同源性達到76%和58%。人類的Hepcidin基因位于19號染色體上，它由3個外顯子和2個內含子組成，其中第3個外顯子編碼了Hepcidin的氨基酸序列。其上游存在轉錄因子CAAT增強子結合蛋白（CAAT enhancer binding protein，C/EBP）、NF-κB和肝核因子（hepatic nuclear factor，HNF）等潛在轉錄因子調節結合位點以及TATA起始結合位點。肝臟中Hepcidin基因表達還受到其上游基因的調節，其中轉鐵蛋白受體2（TfR2）、遺傳性血色素沉著病基因（Hfe）、青少年血色病基因（Hjv）起正向調節作用。最近新發現一種跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS6），它是第一個被證明對Hepcidin表達起著負向調節作用的因子。

Hepcidin主要通過抑制腸道鐵吸收和單核巨噬細胞系統鐵釋放調控鐵穩態，它在肝臟、小腸、網織紅細胞和網狀內皮系統之間傳遞鐵調節信號[16]。高鐵飲食、鐵過載或炎癥因子均引起肝臟Hepcidin表達增加[17]，貧血及缺氧則抑制其表達[18]。Niconlas等[19]發現在上游的刺激因子（upstream stimulatory factor 2，USF2）基因敲除的小鼠模型中出現嚴重鐵過剩，癥狀與遺傳性血色素沉著病極其相似。并隨后證實鐵過度沉積與USF2基因敲除小鼠不能表達下游的Hepcidin基因有關。而Hepcidin高表達的轉基因小鼠在出生幾小時后即死于嚴重的缺鐵性貧血[20]。Nemeth的研究[21]發現，Hepcidin通過調控位于小腸基底外側膜FPl的表達來調控鐵的吸收。Hepcidin首先與腸上皮細胞膜中膜鐵轉運蛋白（FP1）結合，導致細胞膜上FPN1內吞進入細胞，最后在溶酶體降解。隨后Ganz對Hepcidin調控鐵代謝機制作了闡述。他認為在機體鐵貯備過高時，肝臟合成Hepcidin量增加，高水平的Hepcidin與FP1結合后降解，而FP1是目前已知的在脊椎動物中唯一的鐵輸出蛋白通道，也就是阻斷了鐵從腸細胞轉運到血漿，同時也將鐵鎖定在腸細胞、肝臟及巨噬細胞內，而富含鐵的小腸細胞會在2天內脫落排出體外，阻止腸道攝入鐵以及肝臟、巨噬細胞中鐵的釋放和再利用，從而降低循環鐵量。

總之，Hepcidin對單核巨噬細胞系統鐵儲存起正向調控作用，而對腸道鐵吸收起負向調控作用，并通過十二指腸腸細胞以及單核巨噬細胞參與機體鐵穩態的調控。

三、酒精與鐵調節蛋白

酒精不僅可以誘發氧化應激和脂質過氧化反應，還可以增加小腸中鐵及內毒素的吸收，從而激活巨噬細胞產生釋放炎癥因子和活性氧。而鐵、病毒感染、內毒素和自由基在酒精性肝病的病情進展中的作用無異于二次打擊。同樣，Hepcidin在肝臟中表達也受鐵負荷、酒精、丙型肝炎病毒、炎癥因子、缺氧和氧化應激的調節[17，18，22]。在遺傳性血色素病患者中，盡管存在嚴重的肝臟鐵沉積，但因其血清pro-hepcidin低于健康人，患者的鐵吸收仍處于高水平。因此，推測Hepcidin下調就是酒精性肝病患者發生肝臟鐵沉積的重要機制之一。

事實上，無論是在ALD動物模型還是ALD患者、體內實驗還是體外實驗、慢性飲酒還是急性酒精性肝損傷中，研究均發現酒精能夠下調肝臟Hepcidin表達，繼而引起十二指腸DMT1及FP表達增加[23，24]。慢性酒精攝入會引起大鼠肝臟中鐵蛋白升高[25]。Ohtake等[24]觀察到酒精性肝病患者血清pro-Hepcidin明顯降低，酒精性肝病小鼠模型的肝臟hepcidin表達下降，均驗證了這一點。此外，酒精并不改變轉鐵蛋白受體1（TfR-1）、鐵蛋白的表達以及鐵調節蛋白（IRP）的活性，說明酒精調節Hepcidin是作用于其本身而不是靠改變細胞內鐵環境而發揮作用的[23]。Harrison-Findik等人[23]在研究小鼠急性酒精性肝損傷模型時發現乙醇可以減少hepcidin的轉錄因子CAAT增強子結合蛋白（C/EBP）合成，并且抑制其DNA連接蛋白活性。因此，兩者共同作用可抑制肝臟Hepcidin的表達。隨后Harrison-Findik[23]又使用乙醇脫氫酶特異性抑制劑4-甲基吡唑和抗氧化劑維生素E阻斷酒精性脂質過氧化反應后則消除了上述的抑制作用，從而有力地說明了酒精引起的脂質過氧化在抑制肝臟Hepcidin合成中起著重要的作用，其機制是通過影響C/EBP表達來調節肝臟Hepcidin轉錄與合成，并反饋性地增加十二指腸鐵的吸收。

眾所周知，Hepcidin在肝臟實質細胞中特異性的表達，但是與體外實驗相比，發現體內實驗中Hepcidin下降得更為顯著，提示肝臟中有某些非實質細胞參與了調節，例如巨噬細胞，后者在酒精性肝病發病機制中起著重要的作用。酒精能夠下調肝細胞Hepcidin的表達，而炎癥反應則上調Hepcidin的表達。因此，巨噬細胞與炎癥反應在酒精調節Hepcidin中的總體作用一直存有爭議。Nemeth E等[26]通過體外實驗證明TNF-α能夠下調Hepcidin的表達。肝臟實質細胞和肝巨噬細胞在酒精調節Hepcidin過程中共同發揮作用。但Nemeth研究中也發現IL-6可以顯著誘導肝細胞和實驗小鼠表達Hepcidin。那么炎癥因子在酒精調節Hepcidin中的關系以及是否有其他非實質細胞參與其中仍需進一步研究。

四、總結

目前酒精調節肝臟Hepcidin的分子機理已經基本明確。酒精通過脂質過氧化反應抑制C/EBP的結合活性以及肝臟Hepcidin轉錄，從而下調Hepcidin表達。肝臟Hepcidin分泌減少導致小腸轉鐵蛋白表達增加。肝臟Hepcidin代謝紊亂可能是酒精引起鐵沉積的一個基礎病因。酒精性肝病在我國的發病率呈逐年上升趨勢，而鐵作為酒精性肝病的二次打擊因子倍受重視。我國研究顯示表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）能通過類鐵螯合劑作用上調Hepcidin表達，減輕鐵負荷，對酒精性肝病起到保護作用。因此，進一步研究Hepcidin在酒精與鐵穩態的分子機制將有助于早期發現及治療酒精性肝損傷。盡管關于Hepcidin還存在很多疑點，但應用Hepcidin競爭劑和拮抗劑治療和預防貧血以及各種與肝鐵代謝紊亂有關的疾病具有積極的意義。

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