熒光定量PCR法檢測兒童肺炎支原體感染及其臨床意義

劉玉韶

(廣東省中山市博愛醫(yī)院兒保科,廣東中山,528400)

作者采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)技術(shù)檢測本院1 046例疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的患兒,探討FQ-PCR檢測MP的臨床意義。

1 資料與方法

本院2007年10月～2009年7月期間收治的疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的患兒1 046例,年齡出生后4 h～14歲。血液標(biāo)本102例,痰液358例,咽拭子573例,胸水9例,腦脊液4例。

引 物 序 列 P1:5′GCAAGGGT TCGTTATT TG3′,P2:5′CGCCTGCGCTTGCTTTAC 3′熒 光 探 針 序 列 為:5′AGGTAATGGCTAGAGTTTGACTG 3′(試劑由廣州達(dá)安基因診斷中心提供)。痰液用高溫消毒的吸痰器(下面密封,上端塞橡膠塞,一側(cè)接胃管深入患兒氣管取痰,另一側(cè)接硅膠管連接真空泵)抽取受檢者痰液1～3 mL置于無菌試管中。4倍體積4%的NaOH室溫消化30 min,取1 mL至離心管,15 000 r/min離心5 min,生理鹽水洗滌1次,棄上清(血液取淋巴細(xì)胞,生理鹽水洗滌;咽拭子、腦脊液離心取沉淀),加50 μ L DNA 提取液,混勻,沸水浴10 min,10 000 r/min離心5 min,上清液2 μ L做 PCR反應(yīng)。

反應(yīng)管置PE5700自動熒光檢測儀。93℃預(yù)變性2 min,93℃45 s※55℃120 s,40個循環(huán),熒光激發(fā)波長為 487 nm,檢測波長為 525 nm,反應(yīng)結(jié)束,由美國 Perkin ELmer公司PE5700自動熒光PCR儀電腦自動分析結(jié)果。結(jié)果判斷:如果Ct值<30,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性,根據(jù)MP陽性標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出DNA含量(基因拷貝數(shù)/mL)。Ct值=30,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 MP感染檢測結(jié)果

1 046例受檢患兒中,陽性 432例,陽性率41.30%。其中血液標(biāo)本102例,陽性25例,陽性率24.51%;痰液 931例,陽性 392例,陽性率42.11%;胸水7例,腦脊液3例,均未檢出陽性。受檢者中男608例,陽性245例,占 40.30%;女438例,陽性172例,占39.27%,2組比較差異無顯著性。432例MP-DNA陽性患兒均有陣發(fā)性刺激性咳嗽,大多無痰或少痰;308例伴發(fā)熱,呈中度熱或高熱,熱型不規(guī)則,可持續(xù)2周。

2.3 各年齡段PCR檢查情況比較

PCR檢查結(jié)果顯示,各年齡段DNA拷貝數(shù)無顯著性差異,其中學(xué)齡前及學(xué)齡兒童陽性335例,占77.55%,感染率較高。

2.4 不同種類標(biāo)本中MP-DNA的比較

102例血標(biāo)本中MP-DNA的陽性率24.51%,931例咽拭子、痰標(biāo)本中MP-DNA的陽性率42.11%,2者比較差異有顯著性(P<0.05)。

3 討 論

肺炎支原體感染廣泛存在,每3～4年流行1次。平均支原體肺炎占住院肺炎的10%～20%,流行期間可占30%以上。本組血液檢出的陽性率和陽性測量值均數(shù)與痰、咽拭子標(biāo)本的PCR檢查相比,均有顯著性差異,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。若依據(jù)血中MP的PCR檢查為是否MP感染的依據(jù),有可能造成對MP感染的漏診,故不宜取血為標(biāo)本檢查來判斷是否有MP感染。國外報(bào)道從肺炎支原體呼吸道感染的病例血液中直接分離出肺炎支原體,提示肺炎支原體可進(jìn)入血流,有在呼吸系統(tǒng)以外的部位增殖的可能性。作者從21例血液標(biāo)本中檢測出MP-DNA,與之相符。痰、咽拭子陽性率42.11%,明顯高于血標(biāo)本24.51%,P<0.05,且MP-DNA平均拷貝值亦明顯高于血液中,提示僅部分肺炎支原體侵入血液中,引起支原體血癥。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)用于病原體的檢測,其敏感性、穩(wěn)定性是以往其他檢測技術(shù)無法比擬的。但存在基因高效擴(kuò)增造成擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的可能。本實(shí)驗(yàn)所用的熒光定量PCR法原理是:把普通基因擴(kuò)增與分子雜交結(jié)合在一起,在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)一條能識別擴(kuò)增產(chǎn)物的探針,探針采用雙熒光標(biāo)記技術(shù),5′端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán),3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。當(dāng)PCR擴(kuò)增過程中有特異性靶基因時,標(biāo)記探針與目標(biāo)靶基因結(jié)合,在延伸過程中當(dāng)引物延伸到探針位置時,Taq酶利用其5′端外切酶活性將探針降解,使報(bào)告基團(tuán)游離,同時恢復(fù)了熒光特性,從而產(chǎn)生熒光。熒光強(qiáng)度由計(jì)算機(jī)自動分析并換算成DNA拷貝數(shù),從而準(zhǔn)確定量。整個實(shí)驗(yàn)是完全封閉式操作 ,避免了假陽性干擾。該技術(shù)從根本上解決了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的污染和不定量的問題,并通過探針雜交進(jìn)一步提高了特異性,成為替代定性PCR的病原體基因診斷方法。

實(shí)驗(yàn)室對MP相關(guān)檢查常用的方法有:培養(yǎng)法、血清特異性抗體(MP-IgM)檢測法、分子生物學(xué)方法(如DNA檢測法)等。MP分離培養(yǎng)條件要求高,是特異性的診斷方法,但MP生長緩慢,因此臨床應(yīng)用往往受限。MP-IgM檢測法具有快速、特異、廉價等優(yōu)點(diǎn),已作為我國MP感染診斷的確診標(biāo)準(zhǔn)之一,但結(jié)果往往受抗體出現(xiàn)的時相及患兒年齡、機(jī)體免疫系統(tǒng)狀況等多方面的影響。國外早已將PCR診斷技術(shù)應(yīng)用于MP的診斷,但由于普通PCR的電泳檢測,易引起PCR產(chǎn)物交叉污染,有產(chǎn)生假陽性的可能。一般臨床通過血冷凝集試驗(yàn)或血支原體抗體測定來確定MP感染,但兩者的高峰出現(xiàn)得較晚,多為2～4周,且受患兒年齡小、免疫力低、病程短及感染輕等方面影響,單憑血清學(xué)檢測可能漏診。

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