蛋白質和多肽的放射性標記方法研究進展

程秋雁

(江蘇省南京市市級機關醫院藥劑科,江蘇南京,210009)

蛋白質和多肽的放射性標記廣泛用于藥代動力學研究,醫學影像檢查[1],抗體標記,二維電泳[2]等方面,在醫學和藥學領域是一種重要的技術。蛋白質和多肽的標記常用125I或131I標記[3-4]酪氨酸。標記方法一般是用氯氨 T法進行碘放射性標記,用柱層析法和離心超濾法對標記物分離純化,同時用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE電泳法鑒定純化后的標記化合物放射化學純度,用MT T比色法測定標記物的生物學活性。例如徐賢坤等[5]改進的雙相氯氨 T法標記了聚乙二醇化重組人白細胞介素6標記率可達74.5%,高于常規氯氨T法的62.3%,放射性比活度分別為5.151 3×109和4.161×109BqPμ g。經柱層析法和離心超濾法對標記物分離純化后,用三氯乙酸沉淀法測得放射化學純度均能達到 99%以上。用SDS-PAGE電泳法檢測2種標記方法所得的標記物與非標記物的結果表明,常規氯氨T法標記物比非標記物多1條高分子量蛋白帶,認為是標記過程中蛋白質受到部分損傷。改進的雙相氯氨T的標記物與非標記物蛋白質條帶一致,認為蛋白質標記后基本沒有受到損傷。生物活性檢測表明改進的雙相氯氨T標記物與非標記物活性之間無顯著差異,常規氯氨T法標記物活性略低于雙相氯氨T的標記物活性。

放射性標記方法的分類方法有很多,根據標記的過程不同分為直接標記法和間接標記法[6]2大類。直接標記法的標記過程相對簡單,在大多數情況下,放射性核素通過降解多肽分子內的二硫鍵后與自由巰基結合。直接標記法較多應用于大分子蛋白質諸如抗體及其片斷的標記也成功應用于血小板受體結合多肽的標記。然而,直接標記法的標記過程難以控制,也難以了解標記時多肽參與反應的原子數量和放射性核素絡合的幾何形狀,并有可能造成多肽的結構、穩定性、生物活性和藥代動力學發生不可預料的改變。對于不含二硫鍵的多肽直接標記法并不適用,即使對于含二硫鍵的多肽,環狀結構的微小改變對其生物活性也會產生巨大影響。

目前用于蛋白質和多肽放射性標記的元素有很多,例如3H,18F,99mTc,72As,188Re,75Br,86Yt等等,其中各種元素的標記方法和應用范圍也不盡相同。作者對其中幾種元素的放射性標記方法做一下簡單的介紹。

1 放射性砷標記

放射免疫治療屬于內照射治療,可以用較少的單克隆抗體耦聯放射性核素,在腫瘤局部產生足夠的電離輻射生物學效應,達到高效低毒的治療效果[7]。Jennewein等[8-9]在傳統的化學標記砷方法得基礎上建立了新方法對單克隆抗體進行了放射性砷標記。長半衰期的72As(T1/2=26 h)和74As(T1/2=17.8 d)可以減慢生理作用進程,類似于濃集腫瘤組織中單克隆抗體的分布。砷標記化合物方法重復性好,且砷標記化合物有亞毒性和亞藥動學富集作用。他們標記了2個蛋白,分別是嵌合IgG3單抗ch3G4和利妥昔單抗IgG3。其標記方法是:先將抗體用SATA標記,隨后在羥胺的作用下脫去作為保護劑的乙酰基,使抗體帶上巰基,巰基化的抗體可以跟72AsI3或74AsI3反應,得到的產物再水解即砷標記的單克隆抗體。這一方法的產率高(>99.9%),并且在臨床環境中易于操作。

2 188Re標記

內動脈灌注標記顆粒是治療腫瘤的一種有效地腔內放射療法。Wunderlich等[10]發展了一種用簡單可靠的方法對可降解的人血清蛋白進行短半衰期β-發射粒子188Re標記。經過條件的優化,這種188Re標記方法的標記效率可以達到接近100%,并且188Re標記顆粒在體外穩定存在。這一方法包括3個試管,試管1中是9.3 mg(60 μ mol)二羥苯甲酸和 11.4 mg(50 μ mol)氯化琥珀膽堿二羧酸亞錫溶解在2 mL無菌、無熱源注射用水中;試管2包括10 mg人血清蛋白微體,2.4 mg吐溫80;試管3包括150 μ mol酒石酸鈉。試管1中的溶液用注射器完全轉移到試管2中。輕輕震搖試管使人血清蛋白微體懸浮。一定劑量的188Re轉移到含有人血清蛋白的試管2中。為了進行反應,把試管2加熱到95℃,震搖1 h。然后,把試管3中的物質溶于1 mL注射用水中,再把試管2中的溶液加到試管3中,室溫震搖10 min。這個方法可以用一個簡單的試劑盒有效的標記人血清蛋白顆粒。pH值為2,反應90 min,放射標記效率為85%～90%,為了避免洗滌步驟,減少放射性風險,在反應進行1h時加入酒石酸銻鉀,然后pH值從2提高到4～5,發現188Re反應幾乎可以定量。

3 3H標記

糖蛋白的定點P-糖蛋白(Pgp)是ATP依賴藥物泵,用于抵抗多重耐藥的癌細胞。Andrus[11]等得到了一種新的抗多重耐藥的癌細胞的天然化合物:(-)-stipiamide,但是毒性很高。于是其進行了結構修飾得到了無毒的化合物6,7-dehydrostipiamide和truncated-DHS。先合成了DHS,然后用放射性試劑[3H]-BZDC對DHS進行放射性標記,得到了一種新型放射性抗癌試劑。然后,用放射性標記試劑與Pgp進行光親和性反應在365 nm照射下反應1 h,用SDS-PAGE進行檢測。反應加入環孢菌素A后,標記效率提高,大部分Pgp被標記。

另外,3H標記還可以用于蛋白質相互作用的足跡分析。Mousseau[12]等利用穩定的C-3H共價鍵標記對蛋白質之間相互作用進行了分析,得到了較好的效果。

4 11C標記

11C的半衰期為20.4 min,可以用穩定的共價鍵與蛋白結合。常用的11C標記試劑是11C標記的CNBr,11C標記的CH2O,11C標記的CH3I等。其中[11C]CNBr可以將轉鐵蛋白和人血清白蛋白在接近生理條件下(40℃,5 min,pH值8)高特異性標記上[13]。其放射性隨蛋白含量2增加到25 mg/mL而從20%增加到70%～80%。盡管游離的巰基也可以與[11C]CNBr反應,但是[11C]CNBr還是優先與賴氨酸的氨基反應。整個反應時間在30 min之內,標記后半衰期為20 min,可以用于檢測血管和肺的滲透性以及紅細胞比容的分布。[11C]CH2O可以磷酸鹽緩沖液中與人血清白蛋白,纖維蛋白原或促黃體激素的氨基反應,然后在硼氫化鈉的作用下發生還原反應,形成穩定的共價鍵。[11C]CH3I是應用最廣泛的標記前體,人血清白蛋白可以在磷酸鹽中與[11C]CH3I發生反應。但是人血清白蛋白的耐熱能力比一般蛋白要強,所以這些條件并不適合其他蛋白的標記。例如錨定蛋白在甲醇中與[11C]CH3I加熱到80℃反應時難以保持活性的。因為這一蛋白在56℃加熱10 min就會完全失去活性[14-15]。

5 18F標記

18F的半衰期為110 min,18F用于親和標記的在高pH和溫度以及有機溶劑中進行,這些條件會破壞蛋白的生物學活性。因此蛋白要與18F標記的輔基反應。這些輔基必須可以快速與蛋白上的基團發生反應。大多數18F的輔基都是與蛋白上的N-末端氨基或多個賴氨酸的氨基發生反應,選用蛋白中含量較高的賴氨酸含量大大增加了標記的可能性,但是選擇性不高。[18F]氟苯甲醛([18F]FBA)與蛋白的氨基反應,因此最近報道的標記策略傾向于更加有選擇性的方法,例如巰基修飾策略。大多數巰基選擇性修飾劑都是針對半胱氨酸殘基的。由于大多數蛋白中只有少數半胱氨酸,所以特異性標記還是可以實現的。[18F]FBABM對于模式多肽在PBS中反應10 min有很高的產率,但是這個分子中含有一個雜質從而降低蛋白的量。當雜質除去后,其修飾錨定蛋白v巰基的產率達到37%。[18F]FBABM也可以成功的標記低密度膜蛋白,產率也達到了20%。另外還有其他的標記策略,例如一種18F標記的新方法是用Al18F作為標記試劑,Al18F可以作為螯合劑與多肽穩定結合[16-18]。

結 語

蛋白質和多肽的放射性碘標記技術已經成熟,應用也很廣泛。其他的放射性標記技術也在蓬勃發展,放射性元素的種類在不斷的增加,標記策略呈現多樣性,并且蛋白質和多肽的放射性標記技術的應用的范圍也得到了擴大。

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