毛細管電泳芯片的臨床應用現狀

李婧

毛細管電泳芯片的臨床應用現狀

李婧

毛細管電泳；芯片；臨床應用

毛細管電泳芯片（microchip capillary electrophoresis）是在常規毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE）的原理和技術基礎上，利用微加工技術在平方厘米級大小的芯片上加工出各種微細結構，如通道和其它功能單元，通過不同的通道、反應器、檢測單元等的設計和布局，實現樣品的進樣、反應、分離和檢測，是一種多功能化的快速、高效和低耗的微型實驗裝置。該項技術可望發展成微全分析系統和芯片實驗室的主流技術。它的研究和廣泛應用，將使疾病診斷和治療、環境監測、新藥研究開發、食品安全檢測等許多領域產生革命性變化，已成為當今化學、生命科學、微機械、物理、計算機、微電子技術等領域的重要研究課題之一。到目前為止，毛細管電泳芯片已用于糖類化合物的分離檢測、氨基酸對應體的拆分、蛋白質和多肽分析、神經遞質類物質的分離檢測、寡核苷酸的分離、DNA測序和DNA限制性片段分離等分離分析研究。隨著應用實踐的增加，該項技術將成為臨床實驗室的有效分析工具。

1 腫瘤

已有利用毛細管電泳芯片方法分析腫瘤敏感性基因的報道，包括單鏈構象多態性分析和等位基因特異性DNA擴增結合雜交雙鏈分析。BRCA1和BRCA2基因中常見突變與乳腺癌呈強相關性，尤其是在北歐猶太教人群中。利用毛細管電泳芯片，Tian等[1,2]將單鏈構象多態性分析時間降低到約130 s，比傳統方法至少提高了100倍。他們又將等位基因特異性DNA擴增與雜交雙鏈分析聯合，檢測BRCA1和BRCA2基因中每個突變。該系統也被用于分析T和B淋巴細胞增殖失調，結果表明毛細管電泳芯片提供與平板凝膠電泳和傳統毛細管電泳相同的信息，但是分析時間更短（毛細管電泳芯片為160 s，平板凝膠電泳為2.5 h，毛細管電泳為15 min）。Thomas等[3]在充滿各種分離基質的微通道中進行毛細管電泳來快速分析基因組DNA中低豐度點突變的連接酶檢測產物。在來自結直腸腫瘤的DNA中檢測人k-ras癌基因中點突變，在不到120 s內將連接酶檢測反應產物與未連接引物區分，比毛細管凝膠電泳快17倍，只是分辨率輕度降低。Cantafora等[4]用結合競爭和毛細管電泳芯片的逆轉錄PCR評價了參與人類腸道細胞脂類運輸的信使RNA，結果顯示分析特定信使RNA能夠可靠評價CaCo-2細胞中相應基因的表達，并證明膽固醇作為特定因子如LXR-α和FXR正向誘導劑的作用。還可以在芯片上進行酶學分析來測定蛋白激酶。分析試劑通過電滲流被混合在雕刻的通道內，用熒光素標記的七肽作為底物進行酶反應。底物和反應產物被電泳分離，結果證明毛細管電泳芯片對于無法獲得熒光底物而需要進行酶學分析十分有用[5]。

2 心血管相關疾病

現已證明毛細管電泳芯片可以作為分析LDL和同型半胱氨酸來評價動脈粥樣硬化的一種診斷工具[6,7]。而且，還可以通過分析細胞中DNA片段來評價個體心肌細胞的凋亡，從而診斷阿霉素誘導的心肌病，后者化療患者的一種危及生命的狀態。基于毛細管電泳芯片的電化學檢測已被用于分析總同型半胱氨酸和結合蛋白的同型半胱氨酸，該技術可以用于有心血管病風險患者的常規檢測。Kleparnik等[8]在芯片中用CD樣微液體設備進行細胞裂解、電泳和激光誘導熒光測定阿霉素誘導的個體心肌細胞凋亡。通過分析阿霉素處理不同時間的細胞中DNA片段檢測凋亡。結果顯示心肌細胞暴露阿霉素的時間延長與細胞壞死相關。

3 腎臟標志物

分析生物體液中的肌酐、肌酸、尿酸、尿素和對氨基馬尿酸能夠評價腎臟和肌肉功能。現人們已經將芯片分析腎臟標志物與電化學檢測聯合應用。一種方法是將使用肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的酶學生物分析和電泳分離與電流計測定相偶聯。金覆蓋的厚膜電極用于電流計檢測，檢測限為2×10-5～4×10-5mol/L（信噪比為3）[9]。另一種方法是通過脈沖電流測定含氮化合物和更易氧化的尿酸來直接測定腎臟標志物。四種腎臟標志物在5 min內輕松測定。在不到2 min內即可測定肌酐/肌酸比值，而傳統肌酐分析方法需要約20 min[10]。可見毛細管電泳芯片能夠快速、簡便、經濟的測定腎功能，對于零散的臨床檢測和床邊檢測具有潛在的優點。

4 神經系統疾病

毛細管電泳芯片已經被用于分析腦脊液（CSF）標本測定炎性細胞因子和神經功能酶的抑制劑。Lapos等[11]利用毛細管電泳芯片設備結合雙激光誘導熒光（LIF）和電化學檢測裝置分析多發性硬化患者腦脊液標本。基于芯片的免疫吸附分離還可以與毛細管電泳結合用于快速分析腦脊液中炎性細胞因子。一組6個固定抗體被粘附在芯片的注射孔中來分離創傷性腦損傷患者腦脊液中反應性細胞因子[12]。

5 甲狀腺功能

Schmalzing等[13]描述了一種競爭性免疫分析方法測定血清甲狀腺素，原理是在融合的硅芯片中進行電泳分離和LIF檢測。分析速度比傳統的免疫分析和毛細管電泳顯著加快，在約15 min內分離血清中未標記的甲狀腺素。另外，一種使用二茂絡鐵氧化還原標記的基于芯片的電流計競爭性免疫分析已被用于測定三碘甲腺原氨酸。該分析由芯片、標記抗原和靶抗原與抗體的柱前反應、游離和結合的標記抗原的電泳分離和電流計檢測氧化還原標簽組成。最小檢測濃度是1000 μg/L，分析時間130 s[14]。雖然上述方法是用于測定甲狀腺功能，但是將免疫反應、電泳分離和靈敏的檢測系統整合在芯片平臺上能快速進行更多分析物的免疫分析。

6 感染性疾病/病原體

由于某些感染性疾病的急性本質以及日益增加的恐怖威脅，高速高效的毛細管電泳芯片可能成為測定病原體和診斷感染性疾病的有力工具。現可以用毛細管電泳芯片檢測樣本中病毒和細菌的存在。目前多數研究集中于分析提取的和PCR擴增的核酸片段而非完整的病毒或細菌顆粒。

6.1 病毒感染Zhou等[15]開發了一種微液體系統測定嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒。與傳統逆轉錄PCR相比，該系統對于臨床診斷嚴重急性呼吸綜合征患者的咽拭子具有更高陽性率（17/18對12/18，陽性鑒定），且更快速。Chen等[16]定性和定量分析了丙型肝炎病毒。對于定性分析，他們用塑料芯片分析了利用2對擴增5’非編碼區的引物產生的2步PCR產物。毛細管電泳芯片裝置能在不到1.5 min內分辨丙型肝炎病毒的145 bp擴增子。定量分析運用了逆轉錄競爭性PCR。從血清中提取的野生型RNA與已知量的具有相同引物結合區域（刪除了靶RNA特定中心位點的25 bp片段）的重組內標準RNA共同逆轉錄和共同擴增。該結果與商品化雜交分析結果相當，但降低了工作強度。通過分析CSF中提取DNA的PCR產物能進行單純皰疹病毒診斷。Hofgartner等[17]用毛細管電泳芯片分析33個CSF樣本中的已知DNA進行單純皰疹病毒PCR檢測。與已經建立的方法相比，毛細管電泳芯片達到100%靈敏度和特異性的分析時間更短。因為省略了雜交步驟，實時定量熒光PCR也具有快速分析的優點，但是需要昂貴的設備。相反，毛細管電泳芯片技術則具有多方面優點，它能檢測各種熒光標記的臨床標志物，而且除分離和檢測步驟以外還加入了其他實驗功能。Vegvari等[18]發展了一種雜交微設備，用聚氯乙烯載板和融合成U型溝的硅芯片來分析各種標本，包括肽、蛋白、DNA、病毒和細菌。因為融合硅毛細管具有高透光性，適用于紫外線檢測，所以人們期待該設備能得到廣泛應用。

6.2 細菌感染將PCR和CE整合的芯片設備已經被用于分析細菌，如大腸桿菌、葡萄球菌、沙門菌和鏈球菌。Lagally等[19]研發了一種集成化便攜式基因分析系統檢測病原體。該系統可以同時檢測被檢細胞群的血清型和病原狀態以及抗生素抗性。也出現了其它集成細胞裂解、多重PCR擴增和帶有標志物的PCR產物的電泳分離的芯片設備。例如，整合了PCR、微液體泵和電泳的塑料微液體設備可以進行細菌檢測和鑒定，可以成功分析該設備PCR反應產生的大腸桿菌和沙門菌基因組DNA的擴增子[20]。

7 免疫失調

IgG與慢性感染（多克隆增加）或癌癥（單克隆增加）相關，現已出現了幾種毛細管電泳芯片方法檢測IgG濃度增加。Linder等[21]發展了一種非均質競爭性免疫分析測定人IgG，用Cy5-人IgG作為示蹤物，Cy3-鼠IgG作為內標準。定量血清中人IgG十分困難，因為IgG濃度低時SD相對高，濃度高時濃度依賴性又差。但是，區分IgG增加的患者血清標本（慢性感染患者中的35.5 g/L和骨髓瘤患者中的64.7 g/L）和那些IgG濃度在參考范圍內的標本還是較容易的。帶有短毛細管的傳統CE和玻璃微芯片CE設備被用于分析異硫氰酸熒光素標記的抗人IgG。微芯片設備有幾個優點，包括高效、快速、樣本和試劑用量少。Wang等[22]描述了一種在芯片平臺上進行的電化學酶免疫分析。堿性磷酸酶標記的抗體與抗原進行柱前反應，電泳分離游離抗體和抗體-抗原復合物，酶示蹤物和4-氨基苯磷酸底物的柱后反應，電流計檢測被釋放的4-苯酚等操作均在同一設備上進行。

8 糖尿病

胰島素和葡萄糖測定對于診斷糖尿病、胰島細胞失能、低血糖和胰島素瘤十分重要。幾項研究嘗試用毛細管電泳芯片測定胰島素和葡萄糖。Wang等[23]利用雙免疫和酶芯片分析同時測定胰島素和葡萄糖。胰島素免疫檢測使用堿性磷酸酶標記的抗體和柱后加入對硝基苯酚磷酸鹽底物，葡萄糖分析用葡萄糖脫氫酶和NAD+進行。現已研制出基于連續電泳的免疫分析用于監測活細胞激素分泌的微液體芯片。可以用CE競爭性免疫分析檢測胰島分泌的胰島素。可以得到胰島素分泌譜，觀察到胰島素分泌的一期和二期特點。毛細管電泳芯片系統非常適合以高時間分辨率監測活細胞的化學環境，該裝置可以用于常規臨床實驗室。

9 遺傳病

毛細管電泳芯片還可以分析遺傳病如進行性假肥大性肌營養不良（DMD）和血色素沉著病，以及分析基因組DNA。DMD是由X染色體上的營養障礙基因的突變導致的。通過檢測該病攜帶者基因中重復或刪除的外顯子可以鑒定疾病。與DMD相關的刪除/重復傾向于定位在基因的某個區域，因此直接分析一定數目PCR擴增DNA片段即可進行診斷DMD。紅外線介導的PCR擴增與毛細管電泳芯片的DNA分離相偶合的集成微裝置就是為此目的而發展的。其原理是，紅外線輻射直接加熱PCR混合物但不加熱芯片，加快了溫度循環并縮短分析時間。但PCR循環期間芯片篩分基質緩沖液影響了分離效率。因此在成功應用之前必須解決加熱與PCR整合在一起的問題。盡管如此，與傳統方法比較（如Southern blot），PCR-CE極大節省了時間、人力和材料，解決了加熱問題可能會使基于毛細管電泳芯片的診斷裝置用于遺傳病的診斷[24]。Ertl等[25]開發了一種鞘液流動支持的電化學檢測系統，用于毛細管電泳芯片分析等位基因特異的基于PCR的單核苷酸多態性分型，并通過檢測C282Y多態性證明該系統可以用于遺傳性血色素沉著病的診斷。鞘液流動設計最大限度減少了來自檢測系統電泳電位的干擾。與光學檢測系統不同，電化學檢測器更容易小型化，因為不需要龐大的光學元件（即光源、透鏡和濾光片）。多電極的應用使該系統成為便攜式微全分析系統，可以進行復雜混合物的分析。

綜上所述可見，傳統CE革新了DNA分析，在成功完成人類基因組計劃中發揮重要作用；毛細管電泳芯片技術則代表了小型化、快速、自動化和集成分析系統的另一個重要階段，可以更經濟、更快速、更靈敏和更具有選擇性的解決復雜的臨床分析問題。與傳統CE相比毛細管電泳芯片存在一些缺點，如因為分離通道更短導致峰容量更低以及由于芯片焊接材料一般不能使紫外光透過導致無法兼容通用的紫外檢測器。但是快速、樣品制備和衍生步驟容易整合從而進一步減少分析時間和人力消耗是毛細管電泳芯片的重要優點，而成本和速度則是現代臨床分析所關心的重要問題。

盡管目前毛細管電泳芯片仍處于發展的早期階段，但該技術已經顯示在許多臨床分析領域的應用價值。與傳統技術相比，基于毛細管電泳芯片的分子診斷方法被證明在分析速度、節約成本和檢測靈敏度方面具有顯著優點。如上所述，已經有相當多的基于毛細管電泳芯片的新應用。隨著高度自動化、高通量商業化設備的引入，毛細管電泳芯片可能取代常規分析中許多復雜和較慢的分析系統，成為臨床分析的重要設備。

[1]Tian HJ,Jaquins-Gerstl A,Munro N,et al.Single-strand conformation polymorphism analysis by capillary and microchip electrophoresis:a fast,simple method for detection of common mutations in BRCA1 and BRCA2.Genomics,2000,63:25-34.[2]Tian HJ,Brody LC,Fan SJ,et al.Capillary and microchip electrophoresis for rapid detection of known mutations by combining allele-specific DNA amplification with heteroduplex analysis.Clin Chem,2001,47:173-85.

[3]Thomas G,Sinville R,Sutton S,et al.Capillary and microelectrophoretic separations of ligase detection reaction products produced from low-abundant point mutations in genomic DNA.Electrophoresis,2004,25:1668-77.

[4]Cantafora A,Blotta I,Rivabene R,et al.Evaluation of RNA messengers involved in lipid trafficking of human intestinal cells by reverse-transcription polymerase chain reaction with competimer technology and microchip electrophoresis.Electrophoresis,2003,24:3748-54.

[5]Cohen CB,Chin-Dixon E,Jeong S,et al.A microchip-based enzyme assay for protein kinase.Anal Biochem,1999,273:89-97.

[6]Ceriotti L,Shibata T,Folmer B,et al.Low-density lipoprotein analysis in microchip capillary electrophoresis systems.Electrophoresis,2002,23:3615-22.

[7]Pasas SA,Lacher NA,Davies MI,et al.Detection of homocysteine by conventional and microchip capillary electrophoresis/electrochemistry.Electrophoresis,2002,23:759-66.

[8]Kleparnik K,Horky M.Detection of DNA fragmentation in a single apoptotic cardiomyocyte by electrophoresis on a microfluidic device.Electrophoresis,2003,24:3778-83.

[9]Wang J,Chatrathi MP.Microfabricated electrophoresis chip for bioassay of renal markers.Anal Chem,2003,75:525-9.

[10]Garcia CD,Henry CS.Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection.Analyst,2004,129:579-84.

[11]Lapos JA,Manica DP,Ewing AG.Dual fluorescence and electrochemical detection on an electrophoresis microchip.Anal Chem,2002,74:3348-53.

[12]Phillips TM.Rapid analysis of inflammatory cytokines in cerebrospinal fluid using chip-based immunoaffinity electrophoresis.Electrophoresis,2004,25:1652-9.

[13]Schmalzing D,Koutny LB,Taylor TA,et al.Immunoassay for thyroxine(T4)in serum using capillary electrophoresis and micromachined devices.J Chromatogr B,1997,697:175-80.

[14]Wang J,Ibanez A,Chatrathi MP.Microchip-based amperometric immunoassays using redox tracers.Electrophoresis,2002,23:3744-9.

[15]Zhou ZM,Liu DY,Zhong RT,et al.Determination of SARS-coronavirus by a microfluidic chip system.Electrophoresis,2004,25:3032-9.

[16]Chen YH,Wang WC,Young KC,et al.Plastic microchip electrophoresis for analysis of PCR products of hepatitis C virus.Clin Chem,1999,45:1938-43.

[17]Hofgartner WT,Huhmer AFR,Landers JP,et al.Rapid diagnosis of herpes simplex encephalitis using microchip electrophoresis of PCR products.Clin Chem,1999,45:2120-8.

[18]Vegvari A,Hjerten S.Hybrid microdevice electrophoresis of peptides,proteins,DNA,viruses,and bacteria in various separation media using UV-detection.Electrophoresis,2003,24:3815-20.

[19]Lagally ET,Scherer JR,Blazej RG,et al.Integrated portable genetic analysis microsystem for pathogen/infectious disease detection.Anal Chem,2004,76:3162-70.

[20]Koh CG,Tan W,Zhao MQ,et al.Integrating polymerase chain reaction,valving,and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection.Anal Chem,2003,75:4591-8.

[21]Linder V,Verpoorte E,de Rooij NF,et al.Application of surface biopassivated disposable poly(dimethylsiloxane)/glass chips to a heterogeneous competitive human serum immunoglobulin G immunoassay with incorporated internalstandard.Electrophoresis,2002,23:740-9.

[22]Wang J,Ibanez A,Chatrathi MP,et al.Electrochemical enzyme immunoassays on microchipplatforms.Anal Chem,2001,73:5323-7.

[23]Wang J,Ibanez A,Chatrathi MP.On-chip integration of enzyme and immunoassays:simultaneous measurements of insulin and glucose.J Am Chem Soc,2003,125:8444-5.

[24]Ferrance JP,Wu QR,Giordano B,et al.Developments toward a complete micro-total analysis system for Duchenne muscular dystrophy diagnosis.Anal Chim Acta,2003,500:223-36.

[25]Ertl P,Emrich CA,Singhal P,et al.Capillary electrophoresis chips with a sheath-flow supported electrochemical detection system.Anal Chem,2004,76:3749-55.

[2010-05-24收稿，2010-06-20修回]

[本文編輯：韓仲琪]

R454.9

A

261021山東濰坊，89醫院檢驗科（李婧）