食品生物活性物質與結直腸癌DNA甲基化異常的研究進展

梁 云，陳慶森*

食品生物活性物質與結直腸癌DNA甲基化異常的研究進展

梁 云，陳慶森*

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

DNA甲基化是腫瘤發生的一種重要表觀遺傳學變化，并已被證實與結直腸癌的發生發展密切相關。本文介紹DNA甲基化的形成機制以及重要性，結合近期國內外DNA甲基化異常與結直腸癌關系的研究進展，總結食品生物活性物質如何通過調控甲基基團代謝或DNA甲基化轉移酶活性來調節DNA甲基化，從而影響結直腸癌發生發展的機制。

生物活性物質；結直腸癌；表觀遺傳學；DNA甲基化

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，2009 年世界范圍內新增結腸癌病例數為120萬，當年結腸癌致死人數為60萬[1]。據預測，我國結直腸癌的發病率與死亡率在很長一段時期內將穩步上升，結直腸癌已成為我國最常見的惡性腫瘤之一?，F代腫瘤理論認為從良性腫瘤發展為惡性腫瘤是由遺傳基因缺陷以及基因表觀遺學改變共同積累而成的[2]。

表觀遺傳學改變是指DNA序列不發生變化但基因表達卻發生了可遺傳的改變。表觀遺傳學主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和RNA干擾等。研究證明，幾乎人類所有腫瘤都存在著表觀遺傳上的異常。其中甲基化和腫瘤的關系備受關注，檢測DNA甲基化有望成為檢測腫瘤發生的分子標志。表觀遺傳改變與眾多疾病的發生有關，與DNA改變不同的是，表觀遺傳改變是可逆的，從而為一些疾病提供了可靠的營養治療思路。合理飲食是降低癌癥發生風險的最重要手段。食品中的各種生物活性物質在癌癥形成的各個階段均有特定的保護作用。飲食與癌癥發生的眾多途徑有關，包括細胞凋亡、細胞周期的控制與分化、血管生成、DNA修復以及致癌物質的代謝。表觀遺傳機制也成為食品生物活性物質選擇性的激活或沉默基因表達的重要機制。本文通過闡述DNA甲基化機制，并結合近期國內外對DNA甲基化與結直腸癌關系的研究進展，對在甲基化作用機制基礎上食品生物活性物質對結直腸癌的影響進行綜述。

1 DNA甲基化的形成及重要性

DN A甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，是在DNA甲基轉移酶(DNMT)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基，胞嘧啶5'位的氫被甲基取代，成為5-甲基胞嘧啶的過程[3]。目前已知的甲基化轉移酶包含有3個家族：DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1優先作用于半甲基化的DNA，根據親鏈上特異的甲基化位點，在DNA半保留復制出的新生鏈相應位置上進行甲基化修飾，是一種維持甲基化轉移酶，DNMT3a和DNMT3b 主要作用于DNA的從頭甲基化，在原來沒有甲基化的D N A雙鏈上進行甲基化修飾。DNMT2的具體機制尚不清楚[4]。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸位點上，CpG成簇存在的地方稱為CpG島，CpG島長約為0.5～4kb，位于啟動子區。在正常組織細胞中啟動子CpG島不發生甲基化。然而，在腫瘤細胞中啟動子區高甲基化是一個重要的表觀遺傳改變標志。DNA甲基化影響到基因的表達，與腫瘤的發生發展密切相關。Baylins等[5]在1995年提出腫瘤細胞DNA甲基化異常包括整體基因組的低甲基化和CpG島高甲基化，基因組低甲基化通過激活原癌基因的表達來誘發腫瘤的產生，而抑癌基因的高甲基化導致基因表達受到抑制是腫瘤產生的重要分子機制。

2 DNA甲基化與結直腸癌

結直腸癌中基因的改變包括原癌基因及抑癌基因的改變，如DNA錯配修復基因的突變APC、KRAS或TP53的突變[6]等，而事實上，只有10%的結直腸癌會發生基因遺傳學的改變，更多的結直腸癌的發生和發展與表觀遺傳學改變有關，其中最主要的機制是DNA甲基化機制[7]。Esteller等[8]從人類15種腫瘤的600個樣本中利用MSP技術檢測12種基因的甲基化水平，發現在各個不同類型的腫瘤中均存在一個或多個基因甲基化，但是不同腫瘤中基因的甲基化狀態差異顯著。

2.1 結直腸癌與整體基因組低甲基化

最開始人們對腫瘤的分子生物學主要集中在原癌基因假設學說中，認為腫瘤的發生是通過遺傳基因重組和基因突變激活原癌基因，到1983年Feinberg等[9]首次研究并提出了腫瘤細胞低甲基化作為原癌基因激活的一種機制，其后被大量的實驗研究所證實。

結直腸癌在表觀遺傳學上的特征是整體基因組低甲基化伴隨著特異基因高甲基化。甲基化轉移酶活性的降低、組蛋白修飾以及DNA錯配修復的缺陷等均會引起的整體基因組低甲基化。DNA整體基因組低甲基化導致腫瘤發生的主要原因分別是：基因表達異常、基因印記缺失、染色體失活、染色體不穩定性、微衛星不穩定性等。

Esteller等[10]研究發現在散發性結直腸癌中整體基因組甲基化水平降低30%，在家族性增生性息肉綜合癥(FAP)和遺傳性非息肉病性結直腸癌(HNPPC)中檢測其甲基化水平分別降低了43%和42%。相比于正常細胞，腫瘤細胞低甲基化主要發生在微衛星的重復序列中。

Cui等[11]等研究發現由于低甲基化引起的類胰島素生長因子-2基因(IGF2)/H19區域的雜合子丟失(LOI)在40%的結直腸腫瘤組織能檢測出來，基因低甲基化使得染色體更容易破裂，導致染色體不穩定性。

2.2 結直腸癌中CpG島高甲基化

Baylins等[5]報道，啟動子CpG島甲基化普遍存在于人類的各種腫瘤中，很多功能基因如抑癌基因和DNA錯配修復基因通常在腫瘤中未檢測出相關基因發生突變，更多腫瘤的發生是由CpG島甲基化異常引起的基因沉默。

啟動子CpG島甲基化引起基因沉默可能有兩種機制。第一種機制是轉錄因子特異性的結合蛋白與啟動子識別位點的特異性結合，一些轉錄因子，如A P-2、c-Myc、E2F、NF-κB，可以識別含有CpG島的序列，通過甲基化抑制其表達[12]；第二種機制是特異性的轉錄阻遏物與甲基化的DNA直接結合。DNA甲基化信號可以利用針對CpG島序列的甲基CpG島結合蛋白(MeCP)來分析。MeCP1和MeCP2是最早發現的兩種與甲基CpG島結合蛋白復合物，其后又發現了甲基結合蛋白結構域包括MBD1、MBD2、MBD4和Kaiso[13]。MeCP1、MBD1、MBD2和MBD4通過一個甲基結合蛋白結構域實現與甲基化的CpG 島結合，而Kaiso是依靠鋅指結構與CpG島結合。MBD4和DNA錯配修復有關，而通過體外實驗和細胞培養分析發現MBD1、MBD2、MeCP2、Kaiso與組蛋白去乙?；鶑秃衔镒饔脧亩种妻D錄作用。DNA甲基化同時可以影響組蛋白修飾和染色體結構；反過來，也會影響基因的表達。

在散發性微衛星不穩定性結直腸癌(MSI CRC)，80%的病人出現了MLH1啟動子區的異常甲基化，然而只要MSI CRC細胞株在MLH1啟動子去甲基化后，MLH1表達和功能將恢復，細胞株也恢復正常。此研究說明了啟動子區域高甲基化對于結直腸癌的關系。目前，研究與結直腸癌甲基化相關的基因有：細胞周期調節基因(p16INK4a、p15INK4a和Rb)、DNA錯配修復基因(BRCA1、MGMT、hMLH1)、凋亡基因(DAPK、TMS1)等。

表觀遺傳學上把結直腸癌按照CpG島表型分為兩個表型：一類表現為少量的甲基化(CIMP－)；一類為多基因甲基化(CIMP＋)。CIMP＋結直腸癌相比CIMP－結直腸癌KRAS的突變率較高，但是TP53突變率較低，5個經典的CIMP標志物(p16、MINT1、MINT2、MINT3、MLH1)為分辨CIMP提供了一個簡單而具有代表性的方法。

啟動子區域CpG島高甲基化是腫瘤研究的一個熱點問題。然而，在腫瘤發展中有關CpG島甲基化還是存在一些問題沒有得到解決：1)DNA甲基化是腫瘤形成的原因還是結果？2)腫瘤病人病變過程中哪些基因發生甲基化？3)在病變或者轉移過程中什么時候發生甲基化或者基因沉默？4)什么決定腫瘤特異性的甲基化？

2.3 DNA甲基化的動態變化與結直腸癌的發生發展

腫瘤通過表觀機制沉默抑癌基因的表達其中包括結直腸癌的發生。結直腸癌的病理學發展進程為從異型隱窩灶(ACF)開始發展為管狀腺瘤，異型隱窩灶(ACF)和管狀腺瘤均有可能發展為侵入性腫瘤。

異型隱窩灶是結直腸癌發生癌前病變的最初病例學標志，某些特異性的基因位點如RASSF1A、CRBP1、MINT31、CDH13、MINT1、SLC5A8、MGMT在ACF[14]階段發生DNA甲基化增生性息肉是結直腸癌的癌前病變的一個早期事件，P e t k o等[15]發現在增生性息肉中MGMT、CDKN2A、MLH1的甲基化頻率分別為5%、10%和7%，明顯低于在腺瘤中的49%、34%和7%，而在進展性腺瘤中甲基化率更高。大量基因甲基化狀態在腺瘤和腫瘤階段有顯著的變化，表明表觀遺傳學結直腸癌的的發生中占據重要地位。

Kim等[16]發現同一基因甲基化程度在腺瘤早期和進展性腺瘤有明顯的不同，腺瘤、結直腸癌發生甲基化的基因數目逐步上升，這表明異常甲基化是結直腸癌的早期頻繁事件。Huang等[17]發現除了結直腸癌，在異型隱窩灶ACF、結腸腺瘤、增生性息肉和進展性腺瘤均發現p16基因甲基化，表明p16基因CpG島甲基化發生腫瘤惡變前早期，是結直腸癌發生的早期事件。本實驗室對由二甲阱為模型的大鼠結直腸癌的MSP的分析研究中發現，在大鼠結直腸癌早期能檢測p16基因啟動子區發生異常甲基化。

3 結直腸癌與無創性DNA甲基化早期事件的分子標志研究

結直腸癌在腫瘤沒有發生轉移之前能夠通過簡單的手術治愈，因此結直腸癌的早期發現診斷顯得尤為重要，除了篩查檢驗、結腸鏡檢查、糞便隱血檢驗，檢測糞便及血液中啟動子區異常甲基化成為了檢測結直腸癌的一種最具潛力的手段。

3.1 糞便脫落細胞DNA甲基化

檢測糞便中DNA甲基化的改變作為一種新的無創手段，而具有很大的潛力應用于癌癥病人的檢測。Melotte等[18]發現結直腸癌病人70% NDRG4發生甲基化，腺瘤病人中有61% NDRG4發生甲基化，GATA4/5[19]也是結直腸癌中的普遍和特異事件。科學家們致力于研究與結直腸癌特異性相關的基因，包括細胞因子白介素-6家族基因：制瘤素M-β受體(OMSR)基因。OMSR基因甲基化在結直腸癌中具有很高的特異性[20]。在結直腸癌病人糞便DNA中能檢查出38%發生甲基化，其特異性為95%。OSMR甲基化在結直腸癌人Ⅱ期和 Ⅲ期分別為56%、44%、80%的無癌癥對照人群其甲基化為陰性，表明該基因甲基化是診斷結直腸癌發生的一個分子標記。

OSMR、NDRG4和GATA4的高特異性表明了檢測腸癌病人糞便DNA甲基化的意義。另外一個重要基因是分泌性卷曲蛋白家族基因(SFRP)[21]，SFRP基因啟動子甲基化引起的基因沉默導致wnt/β-catenin信號途徑結構失活，通過MSP技術在結直腸癌中能檢測出95% SFRP1發生甲基化，從而可作為檢測結直腸癌的特異性標記基因。

3.2 血清/血漿中的甲基化

Lofton等[22]在血漿中發現了與結直腸癌有關的DNA甲基化的高效的生物標記。選擇了133個結直腸癌病人和179個健康人群中的血清為樣本，在56個參選基因中選擇了HPP1，NGFR和SEPT9三個標記物來檢測其DNA甲基化，結果表明結直腸癌病人血清DNA的3個基因都具有50%以上的敏感性以及健康對照組69%的特異性。

檢測糞便中DNA甲基化相比于傳統的結直腸癌檢測方法結腸鏡活檢等由于其無創性而成為檢測結直腸癌一個重要手段，然而利用糞便或血清DNA異常甲基化檢測結直腸癌也存在一些技術難題。Petko等[23]對結腸性息肉和腺瘤病人結腸鏡檢查，同時通過MSP技術檢測糞便DNA p16、MGMT、MLH1三個基因其甲基化率分別為31%、48%、0%，但是在無息肉的人群中其甲基化率分別為16%、27%、10%。出現這種假陽性的結果的可能原因就是以PCR為基礎的DNA甲基化檢測方法不能檢測到糞便DNA中少量的異常甲基化以及糞便脫落細胞較少。因此，提高糞便DNA異常甲基化的檢測特異性及敏感性是臨床應用一個亟解決的問題。

4 食品生物活性物質與DNA甲基化

表觀遺傳學區別于基因組學的特征在于：表觀遺傳會因為環境、飲食和其他藥物的干擾而影響表觀標志。癌變過程中營養對基因特異性甲基化的改變正在被高度關注。食品生物活性物質影響DNA甲基化主要有兩種機制：第一，食品生物活性物質可以影響甲基基團的供給而調控甲基化過程；第二，食品生物活性物質通過影響DNMT酶的活性從而作用于DNA甲基化。許多研究分別就不同的食品生物活性物質對甲基化的影響從以下方面進行了深入探討。

4.1 葉酸對結直腸癌DNA甲基化的影響

葉酸對于DNA的合成及修復有重要的作用：從脫氧尿嘧啶到胸嘧啶需要通過四氫葉酸還原酶(MTHFR)將

5,10-亞四基四氫葉酸還原成5-甲基四氫葉酸，而限制5-甲基四氫葉酸的攝入會導致S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的細胞水平降低，從而導致胞嘧啶的異常甲基化。這種異常甲基化包括整體基因組的低甲基化和CpG的高甲基化。Giovannicci[24]究表明低葉酸攝入更容易發生結直腸癌病變，這反映了DNA甲基化可能與DNA合成異常有關。

低葉酸攝入引起高水平的同型半胱氨酸(SAH)，從而高水平的SAH將導致DNA低甲基化。Wasson等[25]低葉酸攝入導致p53基因在結直腸癌細胞株中發生低甲基化。Jhaverim等[26]現葉酸缺乏將導致H-cadherin基因的CpG島出現高甲基化。Stempak等[27]究了以非嚙齒類動物和人類結直腸腫瘤細胞為模型，發現葉酸缺乏會影響S-腺苷甲硫氨酸(SAM):S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的比例呈動態變化以及甲基化轉移酶(DNMTs)蛋白的表達。Engelandm等[28]用MSP技術測得在散發性結直腸癌病人組織中，低水平葉酸攝入而高水平酒精攝入的病人的APC、p14ARF、p16INK4A、hMLH1以及RASSF1A基因的CpG甲基化頻率要高于高水平葉酸攝食而少量酒精攝入的結直腸癌病人，且低水平葉酸攝入的結直腸癌病人中出現至少一個甲基化的人數(85%)高于高水平葉酸攝入的結直腸癌人數(70%)。

4.2 植物性化學物對結直腸癌DNA甲基化的影響

植物中除了含有維生素和礦物質，還含有一些植物性化學物質，如植物多酚、類黃酮等。對人體健康具有重要的作用。植物多酚存在于一些常見的植物性食物中，如茶、紅酒等中。Fang等[29]研究表明綠茶中的主要多酚提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)通過直接作用于酶，從而抑制DNMT的活性，并且重新激活腫瘤細胞中的甲基化沉默基因。Yuasa等[30]對食管癌病人的生活方式影響因子研究發現，生活中少喝綠茶會導致CDX2基因CpG島的高甲基化，以上研究表明飲食中的植物多酚能夠影響DNA甲基化狀態，從而作用于表觀遺傳現象的改變。

流行病學和動物實驗表明大豆中的植物雌激素對乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結直腸癌等癌癥有預防作用[31]。大豆消費水平較高的日本其結腸癌、乳腺癌、前列腺癌明顯低于美國[32]。表觀遺傳學可以解釋植物雌激素的抗癌作用。大豆中的主要植物雌激素是金雀異黃酮，被Day等[33]證實可以改變小鼠的CpG島的甲基化狀態，Fang等[34]證實大豆中的其他異黃酮——大豆黃素和大豆苷元同樣具有抑制甲基化轉移酶(DNMTs)的能力，能夠逆轉食管癌和前列腺癌腫瘤細胞CpG島的異常甲基化，從而重新激活基因表達。

4.3 異硫氰酸鹽對結直腸癌DNA甲基化的影響

食物中的異硫氰酸酯類化合物在一定的實驗條件下能夠改變表觀遺傳。異硫氰酸酯類化合物是芥子苷的代謝產物，普遍存在于水田芹菜、花椰菜等十字花科蔬菜中。研究證實異硫氰酸酯類化合物具有抗腫瘤作用[35-37]。

Wang等[38]發現異硫氰酸β-苯基乙基酯(PEITC)作用于前列腺腫瘤細胞LNCap可以使得編碼解毒酶的GSTP1基因啟動子去甲基化以及基因的重新表達。苯乙基異硫氰酸鹽和其他的異硫氰酸鹽一樣，具有抑制組蛋白去乙?；?HDAC)的活性的作用。

4.4 硒對結直腸癌DNA甲基化的影響

硒是維持人類健康的一個重要元素。Davis等[39]通過體外實驗對人類結直腸癌細胞Coca-2細胞基因啟動子甲基化研究發現，當細胞在缺乏硒的條件下培養p53基因啟動子甲基化水平降低。通過動物實驗研究發現，與灌胃硒的大鼠相比，硒缺乏的大鼠肝臟和結直腸均出現顯著的低甲基化，Davis等[40]繼續研究發現與灌胃硒的大鼠相比，硒缺乏的大鼠出現異形隱窩灶的個數明顯比灌胃硒的大鼠多，而注射DNMT1抑制劑-氮脫氧胞嘧啶的大鼠形成隱窩灶數目明顯減少，以及結腸癌細胞HT-29在硒缺乏的情況下與含有硒條件下培養，DNA 低甲基化顯著，Dnmt1蛋白表達量也明顯增多。Davis等[39-40]的一系列研究很好的證實了硒在DNA甲基化機制上對于結直腸癌形成的抑制作用。

5 結 語

DNA異常甲基化是一個重要的表觀遺傳學改變，DNA甲基化能夠改變基因的表達而不需要改變基因的序列，DNA甲基化在腫瘤的發生發展中具有重要作用，已被認為是結直腸癌發生的分子機制之一。DNA甲基化的發展對于結直腸癌的早期診斷及病后營養的改進提供了更廣闊的發展空間。而在大量的流行病學、動物實驗以及人體實驗說明了飲食成分和抗結直腸腫瘤的關系，膳食營養結構不平衡以及具有生物活性功能分子成分獲取不足均可導致整體基因組的低甲基化以及基因區域性高甲基化。因此，多食蔬菜等葉酸含量豐富的食物，保持硒等微量元素的平衡，維持DNA甲基化酶的活性，可有效預防由表觀遺傳學改變引起的腫瘤。

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Research Process on the Effects of Food-derived Bioactive Substances on Aberrant DNA Methylation Associated with Colorectal Cancer

LIANG Yun，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Aberrant DNA methylation, as a vital epigenetic change, has been shown to be closely associated with the occurrence and development of colorectal cancer. This paper reviews recent progress in the mechanism of arrant DNA methylation and its importance as well as the relationship between arrant DNA methylation and colorectal cancer at home and abroad. Besides, the regulatory mechanisms of food-derived bioactive substances on DNA methylation by controlling the metabolism of methyl groups and the activity of DNA methyltransferases so as to influence the occurrence and development of colorectal cancer are herein summarized.

bioactive substances；colorectal cancer；epigenetic change；DNA methylation

Q78

A

1002-6630(2010)21-0422-05

2010-07-17

國家自然科學基金項目(30771524)

梁云(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術。E-mail：xiaozhuyuner99@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、蛋白資源開發與應用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn