CD41標記的微小巨核細胞染色在老年貧血診斷中的應用

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院檢驗科，黑龍江齊齊哈爾 161000)

微小巨核細胞是一類形態異常的小型巨核細胞，見于多種血液病，是骨髓病態造血的特征之一［1］，由于其體積較小，形態多樣，常規瑞特-姬姆薩(瑞-姬氏)染色易與淋巴細胞、幼紅細胞等相混淆，漏檢率高，從而導致檢出率低而限制了在診斷中的價值。我們采用CD41標記的微小巨核細胞染色法(SAP染色法)檢測了107例老年貧血患者骨髓涂片，以探討微小巨核細胞的數量和類型在老年貧血診斷中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 資料

選擇2004年1月至2008年12月在我院門診和住院患者，年齡60歲以上，Hb＜100 g·L－1的患者107例，其中男61例，女46例;骨髓增生異常綜合征(MDS)19例，巨幼紅細胞貧血(MA)27例，缺鐵性貧血(IDA)11例，多發性骨髓瘤(MM)10例，慢性病性貧血(ACD)17例，原發性血小板減少性紫癜(ITP)8例，溶血性貧血(HA)3例，腎性貧血(RA)2例，再生障礙性貧血(AA)5例，純紅再障(PRCA)3例，慢性再生障礙性貧血(CAA)2例。以上病例均已確診，診斷標準依據文獻［2］。

CD41標記的微小巨核細胞染色試劑盒購自協和干細胞工程有限公司，瑞-姬氏染色液購自珠海貝索(BASO)生物技術有限公司。

1．2 方法

常規進行骨髓涂片(約2．5 cm×3 cm大小)，然后進行普通的瑞-姬氏染色和SAP染色。SAP染色法步驟如下:(1)將骨髓涂片放入固定液中(甲醇∶丙酮=1∶1)固定90 s，取出晾干。(2)在骨髓片上滴加生物素-鼠抗人CD41抗體，室溫放置40 min，然后用PBS洗滌2次，每次5 min。(3)滴加堿性磷酸酶-鏈霉卵白素二抗，室溫放置30 min，然后用PBS洗滌2次，每次5 min。(4)顯色:取1 mg堅固紅加1 ml底物溶液溶解(新鮮現配)，混勻后滴加于骨髓片上，室溫放置15 min。鏡下觀察，待胞膜或胞漿出現明顯的紅色后用自來水輕輕沖洗，晾干。然后用蘇木素復染60 min，自來水沖洗，用0．5%氨水返藍5 s，自來水沖洗后晾干，鏡檢。

1．3 統計學處理

采用SPSS 11．0統計軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 SAP染色法陽性細胞形態

顯微鏡下觀察細胞核呈藍色，胞膜或胞漿呈紅色標記的為陽性細胞;無紅色標記的為陰性細胞(圖1、2)。

圖1 SAP染色淋巴樣小巨核細胞 ×1 000

2．2 微小巨核細胞形態

分為4型:Ⅰ型為淋巴樣小巨核細胞，直徑＜12 μm，核圓形且多凹陷，胞漿較少，常有毛狀或泡狀突起似撕紙狀，強嗜堿性呈云霧狀，少有顆粒;核多偏一側，染色質濃集，結構不清，通常無核仁(圖1、2)。Ⅱ型為單元核小巨核細胞，直徑12～25 μm，胞漿量比淋巴樣小巨核細胞多，有突起及偽足，漿內有紫紅色粉塵樣顆粒，周邊常有血小板附著。Ⅲ型為大單元核巨核細胞，直徑25～40 μm，胞漿內充滿粉塵樣顆粒;核圓形或橢圓形，常偏位。Ⅳ型為多元核小巨核細胞，直徑12～40 μm，胞漿與單圓核小巨核細胞類似;細胞核多至10余個。

圖2 瑞-姬氏染色淋巴樣小巨核細胞 ×1 000

2．3 老年貧血各疾病組瑞-姬氏染色和SAP染色巨核細胞數量

見表1。SAP染色的骨髓片中巨核細胞數明顯高于瑞-姬氏染色，兩者巨核細胞的檢出率差異有統計學意義(P ＜0．01)。

2．4 107例老年貧血骨髓巨核細胞瑞-姬氏染色和SAP染色小巨核細胞陽性率和類型

見表2。

表1 瑞-姬氏和SAP染色法骨髓片中巨核細胞中位數比較 個·片－1

表2 老年貧血各疾病組骨髓巨核細胞瑞-姬氏和SAP染色小巨核細胞陽性率和類型

通過表2可以看出，不同疾病組比較，MDS組小巨核細胞陽性率最高，4種類型小巨核細胞均可見到;RA、AA、PRCA、CAA組均未見到小巨核細胞。小巨核細胞陽性率由高到低依次為MDS＞ITP＞MA＞ACD＞MM＞IDA。HA組病例少且有1例陽性，未作比較。除MDS組外，ITP、MA組等均未檢出淋巴樣小巨核細胞。AA、CAA組等疾病骨髓受抑，未檢出小巨核細胞，可以認為是與MDS的重要區別。ITP、MA等疾病組雖然可見小巨核細胞，但均未檢出淋巴樣小巨核細胞。可見Ⅰ型小巨核細胞是MDS的一個重要特征之一。

3 討 論

隨著我國進入老齡化社會，老年性疾病發病率逐年提高。國內文獻報道，老年貧血發生率為7% ～28%，占同期住院老年患者的57．3%［3］。本組資料顯示，60歲以上老年人MA和MDS發病率分別排在第1和第2位;MA是由于葉酸、VB12缺乏引起細胞內DNA合成障礙，導致細胞核發育障礙所致的骨髓三系細胞核漿發育不平衡及無效造血性貧血，以骨髓中粒系、紅系、巨核系三系細胞出現巨幼變為其特征;而MDS是一組獲得性造血功能嚴重紊亂的造血干細胞克隆性疾病，其特點為骨髓中一系或多系血細胞發育異常，伴有不同程度的病態造血［4－5］。因此 MDS、尤其在早期的難治性貧血階段(MDS-RA)，其實驗室檢查、特別是骨髓細胞形態學方面與MA有極多相似之處，給臨床診斷及鑒別診斷帶來困難。

CD41a抗體是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的特異性抗體，是巨核細胞-血小板系統的獨特標記［6］。對于常規瑞-姬氏染色形態學難以識別的小巨核細胞(特別是淋巴樣小巨核細胞)，通過SAP染色法，小巨核細胞核呈藍色，胞膜或胞漿呈紅色，低倍鏡下易于辨認［1，7－8］，因此具有重要的鑒別意義。

目前病態小巨核細胞已被列為MDS的診斷指標之一［9］。由于臨床常規進行巨核細胞檢查，一般是先在低倍鏡下進行巨核細胞計數，然后換油鏡分類，所以與淋巴細胞、幼紅細胞大小相似的小巨核細胞往往容易漏檢，從而延誤診斷。采用SAP染色法可以明顯提高小巨核細胞的檢出率，對于MDS的早期診斷及其鑒別診斷具有重要的臨床價值。SAP染色法比傳統的APAAP染色法、親和素-生物素-過氧化物酶法更加敏感、特異［1，10］，具有操作簡便、結果易觀察、成本低等優點。

綜上所述，本研究應用CD41標記的SAP染色有助于對老年性貧血的診斷和鑒別診斷，特別是對老年MDS的診斷有極其重要的臨床意義，為早期治療提供可靠的依據。

［1］龔旭波，吳先國，盧興國，等．CD41標記微小巨核細胞染色法及其應用價值探討［J］．中華血液學雜志，2008，29(6):420-422．

［2］張之南．血液病診斷及療效標準［M］．2版．北京:科學出版社，1998:10-380．

［3］沈建良，楊平地，岑堅，等．老年貧血81例診斷分析［J］．中華內科雜志，2003，42(3):198．

［4］范賢斌，徐志，盧興國．巨幼細胞性貧血及骨髓增生異常綜合癥病態巨核細胞和多小核細胞核象的觀察［J］．中國實驗診斷學，2006，10:1214-1215．

［5］SHI X D，HU T，FENG Y L，et al．Study on bone marrow megakaryocytes in children patients with myelodysplastic syndrome［J］．Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2004，12(1):74-78．

［6］許文榮，谷俊俠．臨床血液學檢驗［M］．南京:東南大學出版社，2001:94．

［7］DAS R，HAYER J，DEY P．Comparative study of myelodysplastic syndromes and normal bone marrow biopsies with conventional staining and immunocytochemistry［J］．Quant Cytol Histol，2005，27:152-156．

［8］SHI X D，HU T，FENG Y L，et al．A study on micromegakaryocyte in children with idiopathic thrombocytopenic purpura［J］．Zhonghua Er Ke Za Zhi，2004，42(3):192-195．

［9］趙新民．小兒骨髓增生異常綜合癥診療建議［J］．中國實用兒科雜志，1999，14:442-443．

［10］COOPER K，IIAFFAJEE Z，TAYLOR L．Comparative analysis of biotin intranuclear inclusions of gestational endometrium using the APAAP，ABC and the PAP immunodetection systems［J］．J Clin Pathol，1997，50:153-156．