胰腺十二指腸同源盒 -1在乳腺癌分子亞型中的表達及臨床意義

施 華,宋旭東,張曉霞,張志勇,朱海燕

對乳腺癌的治療研究發(fā)現,對同一臨床分期及病理類型的乳腺癌,采用同一治療方案的療效可出現明顯不同。隨著分子生物學技術的發(fā)展,越來越多的研究證實乳腺癌預后與許多分子標志物密切相關。2000年,Perou等[1]在總結分析前人發(fā)現的基礎上,使用 cDNA微陣列研究發(fā)現了乳腺癌生物學上的差異,并提出乳腺癌的分子分型。本研究通過免疫組織化學和實時定量 PCR法探討胰腺同源合 -1(PDX-1)與乳腺癌分子分型的關系,為臨床制定乳腺癌的個體化治療方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集唐山市工人醫(yī)院2005年 1月—2008年 5月術中切取的石蠟和新鮮標本各 200例。患者術前未經任何治療,標本經術中快速病理診斷均為乳腺浸潤性導管癌。

1.2 主要試劑 二抗 PDX-1、雌激素受體 (ER)、孕激素受體 (PR)、第二號人類表皮生長因子受體 (Her-2)、細胞角蛋白 5＆6(CK5/6)和上皮生長因子受體 (EGFR)等免疫組化試劑購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。SYBR Green PCRⅠ、Rnase酶、M-MLV反轉錄酶、Taq酶、Olig(dT)15引物均購自美國Promega公司,dNTP購于上海生工生物工程技術服務有限公司,PDX-1引物(上游 :5′-CTTG GGTATGGATCTGTG G-3′, 下游:5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′)和 β -actin引物 (上游 5′-CCATCATGAAGTGTGACGTGG-3′, 下游:5′-GTCCGCCTAGAAG CATTTGCG-3′)購自北京奧科公司。

1.3 主要方法 免疫組化采用 EnVision法,詳細操作過程參照說明書。用已知陽性乳腺癌切片做陽性對照,以 PBS代替一抗做空白對照[2]。隨機觀察計數 10個高倍視野的 PDX-1蛋白的陽性表達細胞數,平均每高倍鏡視野的陽性腫瘤細胞數≥15%即判斷為陽性。其中 Her-2以≥30%的細胞膜顯色為陽性。

提取組織總 RNA按照 Total RNA isolation system說明書操作。cDNA合成的反應體系為:5×Revesre trnascripaste 5.0 μl,dNTP 2.0 μl,RNasin 0.5 μl、MMLV RTase0.5μl(總體積 20μl),37℃60 m in、95℃ 5 min得到 cDNA溶液。PCR反應體系為:單鏈 cDNA 1μl、SYBR Green PCR I 1 μl、 10 ×PCR buffer 5μl、 PCR上游引物 1.5μl、 PCR下游引物 1.5μl、 MgCl27μl、 Taq DNA Polymerase0.5 μl、 dNTP 1 μl、 DEPC處理過的水 33μl。溫度條件:94℃10min、 94℃30 s、57℃ 30 s、 72℃ 30 s共 45個循環(huán)。每個樣品中 PDX-1 mRNA值以相對量表示 (N=PDX-1 Ct值 /β-actin Ct值)。

1.4 分型標準 乳腺癌分子亞型參照Nielsen分型標準[3],以免疫組化結果進行分型:(1)腺腔 A型:ER(+)/PR(+)、Her-2(-);(2)腺腔 B型:ER(+)/PR(+)、Her-2(+);(3)Her-2過表達型:ER(-)/PR(-)、Her-2(+);(4)基底細胞樣型:ER、PR和 Her-2均為 (-),CK5/6和 (或)EGFR(+);(5)未分類型:ER、PR、Her-2、CK5/6、EGFR均(-)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件行 χ2檢驗和方差分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗結果顯示 PDX-1蛋白和 mRNA在乳腺癌管腔 A型和管腔 B型中的表達顯著低于 Her-2過表達型、基底細胞樣型和未分類型 (P＜0.05,見表 1)。

表 1 PDX-1蛋白和 PDX-1mRNA在乳腺癌分子亞型中的表達Tab le 1 Expression of PDX-1 protein and PDX-1 mRNA in molecular subtype of breast cancer

3 討論

隨著對乳腺癌的深入研究發(fā)現,乳腺癌是一類在分子水平上具有高度異質性的疾病,傳統(tǒng)的病理形態(tài)學診斷及分期已不適應腫瘤學研究的發(fā)展需求,從分子水平對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理學機制及生物學行為進行研究已成為當前的研究方向。以腫瘤分子表達差異為基礎的乳腺癌分子分型的提出將對于解決腫瘤的異質性、分期的合理性、預后判斷的準確性及乳腺癌的個體化治療提供重要的依據。因此,本實驗選擇在乳腺癌分子分型的基礎上分析PDX-1的表達情況。

PDX-1是胰腺胚胎發(fā)育中關鍵的轉錄因子,具有調節(jié)胚胎期胰島細胞發(fā)育、增殖、分化和成熟及 β細胞的分泌功能[3]。Tirone等[4]發(fā)現用 RIP(rat insulin promoter)/tk(thymidine kinase)轉染鼠胰島瘤 NIT-1細胞,可預防低血糖癥和腫瘤生長。此后,有研究進一步證實PDX-1不僅與胰腺癌的發(fā)生有關[5-6],還可用于胰腺、胃腸及肺臟腺癌的鑒別診斷。我們前期的研究亦發(fā)現 PDX-1在乳腺癌中的表達顯著高于癌旁組織和乳腺良性病變組織[7],提示 PDX-1參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Levy等[8]對體外乳腺癌AU565細胞株的研究發(fā)現,PDX-1 mRNA在乳腺癌細胞株中表達并激活 RIP,外源性 PDX-1能提高 LacZ在 AU565中的表達。因此他們認為 RIP-TK/GCV治療對乳腺癌細胞株有細胞毒性,外源性PDX-1提高細胞毒性。這一實驗結果證明了利用腫瘤細胞某些特異抗原轉錄基因表達高的特點,啟動藥物前體轉化酶激活,達到特異性殺傷腫瘤細胞的途徑是可行的。本實驗結果顯示 PDX-1蛋白和mRNA在乳腺癌管腔型中的表達顯著低于其他分子亞型,臨床檢測 PDX-1蛋白或mRNA的表達,有助于乳腺癌的臨床病理分型。此外,乳腺癌治療方案的選擇主要取決于癌細胞 ER、PR及 Her-2的表達。其中管腔型者為雌激素和 (或)孕激素受體表達陽性,適合激素內分泌治療。結合本實驗的結果,我們推測對于 ER陰性的患者在不適宜進行內分泌治療的情況下,可以進行針對 PDX-1的基因治療。PDX-1在乳腺癌中的臨床意義與對腸癌的研究結果[9]相似,有望成為評判乳腺癌預后、分子分型和基因治療的參考指標。

本實驗僅對 PDX-1與乳腺癌分子亞型之間的關系進行研究分析,未能全面反映 PDX-1對乳腺癌生物學行為的影響,還有待更深層次的探討。

1 Perou CM,Sorlie T,Eisen MB,et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature,2000,406(6797):747-752.

2 Nielsen TO,Hsu FD,Jensen K,et al.Immunohistochem ica and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(16):5367-5374.

3 Gannon M,Ables ET,Crawford L,et al.pdx-1 function is specifically required in embryonicβcells to generate appropriate numbers of endocrine cell types and maintain glucose homeostasis[J].Dev Biol,2008,314(2):406-417.

4 Tirone TA,Fagan SP,Templeton NS,et al.Insulinoma-induced hypoglycemic death in m ice is prevented with beta cell-specific gene therapy[J].Ann Surg,2001,233(5):603-611.

5 Quint K,Stintzing S,Alinger B,et al.The expression pattern of PDX-1,SHH,Patched and G li-1 is associated with pathological and c linical features in human pancreatic cancer[J].Pancreatology,2009,9(1-2):116-126.

6 Srivastava A,Hornick JL.Immunohistochemical staining for CDX-2,PDX-1,NESP-55,and TTF-1 can help distinguish gastrointestinal carcinoid tumors from pancreatic endocrine and pulmonary carcinoid tumors[J].Am J Surg Pathol,2009,33(4):626-632.

7 施華,宋旭東,張曉霞,等 .乳腺癌組織中 PDX-1蛋白及mRNA的表達變化及意義 [J].山東醫(yī)藥,2009,49(42):102.

8 Levy S,Zhou B,Ballian N,et al.Cytotoxic gene therapy for human breast cancer in vitro[J].J Surg Res,2006,136(1):154-160.

9 Ballian N,Liu SH,Brunicardi FC.Transcription factor PDX-1 in human colorectal adenocarcinoma:a potential tumormarker?[J].World J Gastroenterol,2008,14(38):5823-5826.