番茄紅素對大鼠缺血再灌注腦組織損傷的干預作用

毛旭娟,張俊峰,梁建芳,鄭繪霞

(1.山西醫科大學,山西 太原 030001;2.山西體育職業學院,山西 太原 030006;3.山西醫科大學第一醫院,山西 太原 030001)

番茄紅素(lycopene)是目前已知最有效的抗氧化活性物質,具有極強的清除自由基能力,在抗癌、預防心腦血管疾病、提高免疫力、延緩衰老等方面有很好的功效。近年來的研究表明,番茄紅素可以通過消除自由基、增強機體組織抗氧化能力等作用,達到保護組織器官的目的。腦缺血再灌注的損傷機制雖然目前不是十分明確,但發生氧化損傷、細胞膜的破壞是大多數研究已經證實的。本實驗借助大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO),通過觀察番茄紅素對大鼠腦組織基質金屬蛋白酶-9(Metalloproteinase-9,MMP-9)的表達、腦含水量的影響,來研究探討番茄紅素在腦缺血再灌注損傷中的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑及設備

雌性 Wistar大鼠 22只,體重230 g～330 g,購于山西醫科大學生理實驗室。適應性喂養 1周,隨機分為三組:假手術組(sham組)6只,缺血再灌注組(IR組)8只,番茄紅素組(LP組)8只。實驗造模完成,動物蘇醒后參考 Longa5分評分法,2分或 2分以上者入選本實驗,2分以下者剔除。所有手術組大鼠經取腦證實有明確梗塞灶者,被最終確認入選實驗分析,否則棄去所有數據,補充動物。番茄紅素(北京威創康比特公司),MMP-9抗體(北京博奧森生物技術有限公司)SABC染色試劑盒、DAB顯示試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物模型制作方法

線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型(MCAO),缺血2 h后再灌注。基本步驟:大鼠于手術前12 h禁食,隨意進水;稱重后,用 10%水合氯醛(4m L/kg)腹腔麻醉;剪去頸前部手術區毛發,消毒皮膚并于頸部行25mm常規縱行切口,暴露并鈍性分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA);結扎 ECA與 CCA,用動脈夾夾閉 ICA遠心端;迅速于 ECA與ICA分叉下方剪一切口,將一預先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈,去除動脈夾,插入深度為(18±0.5)mm,直到有輕微阻力感為止,實現大腦中動脈阻塞導致腦缺血。結扎入口處,尼龍線外留約1 cm,將慶大霉素注射于傷口處,全層縫合傷口。2 h后輕輕提拉所留線頭至 CCA,由對側頸動脈系統、基底動脈經過 Willis共同維持損傷側頸內動脈、大腦中動脈的血液供應,實現大腦中動脈再灌注,造模完成。

1.3 給藥方法

LP組于術前給番茄紅素7.2mg/(kg?d)灌胃 1周[1],最后一次灌胃后30 min進行實驗操作。IR組缺血2 h再灌注22 h,術前等量生理鹽水灌胃 1周;sham組只結扎頸內動脈和頸外動脈,不插入線,其他操作與IR組相同。

1.4 取材和指標的檢測

大鼠腦缺血2 h再灌注22 h,用10%水合氯醛深度麻醉動物后開胸暴露心臟,經升主動脈插管剪開右心耳,用生理鹽水250m L快速沖洗,斷頭取腦,在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫組織化學法檢測腦組織MMP-9。免疫組織化學染色法嚴格按照說明書實驗步驟進行,采用 BI-2000醫學圖像分析系統分析平均光密度質,每張隨機取 5個視野,計算陽性細胞數。取平均值作為統計參數。

1.5 腦組織含水量測定

采用干濕重法。大鼠于缺血再灌注后,濾紙吸干腦組織表面水份,在電子天平上稱得其濕重后即刻置于烤箱,100℃恒溫烘烤24 h至恒重,精確稱量干重,計算含水量。腦組織含水量 =(濕重 -干重)/濕重 ×100%。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 免疫組化法腦組織 MMP-9表達(見表 1)

表1 各組 MMP-9的陽性細胞數及平均光密度質(±s)

表1 各組 MMP-9的陽性細胞數及平均光密度質(±s)

注:*IR組 、LP組各指標與sham組比較均P＜0.05,#LP組與 IR組陽性細胞數比較P＜0.05,△平均光密度質比較P＜0.05

組別 n 陽性細胞數 平均光密度質sham組 6 0 0 IR組 8 18.25±7.38* 0.366±0.011*LP組 8 9.88±2.10*# 0.242±0.010*△

表1對各組的陽性細胞數研究顯示,LP組和 IR組腦組織 MMP-9表達明顯,與 sham陽性細胞數比較P＜0.05。LP組與 IR組比較,MMP-9的陽性細胞數減少(P＜0.05);平均光密度質明顯降低(P＜0.05)。

2.2 番茄紅素對缺血再灌注后大鼠腦含水量的影響(見表 2)

表2 各組大鼠腦含水量比較(±s) %

表2 各組大鼠腦含水量比較(±s) %

注:*IR組、LP組與sham組比較均P＜0.05,#LP組與IR組比較P＜0.05

組別 n 腦含水量sham組 6 76.63±1.20 IR組 8 81.73±1.19*LP組 8 78.56±1.17*#

表2結果顯示,IR組、LP組與 sham組比較差異有統計學意義,均(P＜0.05)。LP組與 IR組比較差異有統計學意義(P＜0.05),表明番茄紅素能明顯減少腦缺血再灌注大鼠的腦含水量。

3 討論

MMPs是分解細胞外基質(ECM)的蛋白酶類中最重要的一類。其中 MMP-9又稱基質溶素-9,是基質金屬蛋白酶中的重要成員,與腦血管病和血腦屏障的完整性密切相關。研究證實,在發生缺血再灌注損傷后,缺血腦組織中 MMP-9表達會明顯增高[2,3]。MMP-9損傷血腦屏障后可以引起血管源性腦水腫,從而腦組織發生重要的病理改變[4]。因此,干預 MMP-9的表達可以有效地減少缺血再灌注后腦組織的損傷。

番茄紅素(lycopene)是具有極強的清除自由基能力的天然抗氧化劑,近年來的研究表明,番茄紅素可以通過直接淬滅氧自由基、增強機體組織抗氧化能力等達到保護組織器官的作用。已有動物實驗證實番茄紅素有腦保護作用,其機制也與其清除自由基有關,可以減輕腦水腫的發生。有研究表明大鼠腦缺血再灌注后番茄紅素可以減輕腦水腫,降低腦梗死體積,同時可抑制腦組織中丙二醛的產生。此外,番茄紅素可抑制皮膚、肺和肝組織內的 MMP-9表達[5]。

抗氧化劑能否減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷研究報道很少。本實驗發現,番茄紅素干預能使大鼠大腦中動脈缺血再灌注的腦組織中 MMP-9表達減少(均P＜0.05),腦含水量降低(P＜0.05),提示番茄紅素能通過降低大鼠大腦中動脈缺血再灌注后缺血側腦組織中 MMP-9的表達。特別是在血管源性腦水腫發生的高峰時期24 h～48 h之間,可以推測番茄紅素可以通過抑制 MMP-9的產生從而減少腦水腫達到保護腦組織。番茄紅素抑制 MMP-9活性的機制尚不清楚。可能由于 MMP-9基因結構中具有激活劑蛋白-1(AP-1)的結合位點,番茄紅素可通過抑制核轉移因子AP-1影響 MMP-9的活性。另有研究認為超氧化物歧化酶能減輕腦損傷后 MMP-9的表達[6],番茄紅素的抗氧化劑清除自由基的作用可能是影響 MMP-9活性的另一原因。機體組織局部氧化應激發生時,自由基的產生增多都可以合并有 MMP-9表達的增加[7]。

[1] 王會娟,李馨儒,黃燕清,等.番茄紅素微囊的體內外藥劑學行為[J].藥學學報,2005,40(9):787-791.

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[3] Zezong Gu,Jiankun Cui,Stephen Brown,et al.A Highly Specific Inhibitor ofMatrixMetalloproteinase-9 Rescues Lam inin from Proteolysis and Neurons from Apoptosis in TransientFocalCerebral Ischem ia[J].Neuroscience,2005,5(27):6401-6408.

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[5] 高元興,秦華東.抗氧化劑在降低肝缺血再灌注損傷中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(5):911.

[6] Morita-Fujimura Y,Fujimura M,Gasche Y,et al.Overexpression of Copper and Zinc Superoxide Dismutase in Transgenic Mice Prevents the Induction and Activation Ofmatrix Metalloproteinase after Cold Injury-Induced Brain Truma[J].Cere Blood Flow Metab,2002,20:130-138.

[7] 吳 旻,李玉光.基質金屬蛋白酶和氧化應激在大鼠動脈粥樣硬化中的表達[J].中國心血管病研究雜志,2007,5(1):55-57.