槲皮素和8-Br-cAMP對腫瘤增變基因表型改變的影響

李 璇

腫瘤的增變基因表型（mutator phenotype）學說主要是指由于調控DNA穩定/修復基因的突變（mutator增變子）而引起監督DNA損傷的抑癌基因，如p53、p16等基因的失活/突變而導致腫瘤細胞對多藥耐藥性（MDR）增加和抗凋亡等腫瘤惡性的表型。

在失去生長、增殖調控的腫瘤細胞內PKC信號轉導途徑呈激活狀態，而在PKA信號轉導途徑中PKAⅡ型受體處于失激活狀態。槲皮素（類黃酮）具有阻抑PKC/TPK信號轉導途徑的作用。8-Br-cAMP是PKARⅡ的激動劑。本文主要探討了槲皮素和8-Br-cAMP單獨作用或聯合應用是否可呈現不同信號轉導途徑的互補效應和對增變基因表型變動的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Bcl-2單克隆抗體（Santa Cruz）、Bax、XRCC1單克隆抗體（Lab Vision），TUNEL凋亡試劑（Promega），8-BrcAMP（Sigma），槲皮素（上海試劑二廠）；POLB單克隆抗體（Lab Vision），MRP單克隆抗體（Zymed）。

1.2 細胞培養及分組 將培養的Eca-109細胞隨機分為4組：①8-Br-cAMP（Br）組，加終濃度為2×10-5mol/L的8-BrcAMP；②槲皮素（Q）組，加槲皮素終濃度為43 μmol/L；③8-Br-cAMP和槲皮素共同作用（Br+Q）組，加終濃度為2×10-5/L的8-Br-cAMP和槲皮素終濃度為43 μmol/L；④對照組（C），僅加DMEM培養液（含10%胎牛血清）。各組細胞均培養48 h后收集細胞，制成1×107/ml細胞懸液滴加至預先處理過的玻片和硝酸纖維素膜（NCM）上。

1.3 細胞凋亡率檢測 應用TUNEL法檢測各組細胞的凋亡率。

1.4 蛋白免疫反應性的檢測 應用免疫細胞化學技術分別對滴片進行MRP、POLB、Bcl-2、Bax和XRCC1免疫反應性（IR）的強弱和定位觀察。應用免疫斑點印跡技術檢測NCM膜上的POLB、MRP、Bcl-2、Bax和XRCC1的印跡并應用薄層層析掃描儀（Shimadu）以470 nm波長進行掃描。計總積分值。

1.5 統計學處理 采用SPSS10.0軟件，計量資料用單因素方差分析，結果判定以α=0.05為水準。

2 結 果

2.1 各組細胞凋亡率 C組為4%，Br組為42%，Q組為35%，（Br+Q）組為70%，見圖1～4。（Br+Q）組>Br組或Q組>C組，P<0.01。

2.2 Bcl-IR、Bax-IR和XRCC1-IR Bcl-IR和Bax-IR呈棕黃色顆粒，位于胞質內；XRCC1-IR呈棕黃色顆粒，多位于胞核，也可見到有些細胞的整個細胞呈陽性反應。四個實驗組的免疫組化信號強弱積分值見表1。

2.3 各組Eca-109細胞的Bcl-2-IR、Bax-IR和XRCC1-IR的相關性 Bcl-2-IR與Bax-IR呈顯著負相關，r=-0.984 9，P<0.01；Bcl-2-IR與XRCC1-IR呈顯著正相關，r=0.992 6，P<0.01；Bax-IR與 XRCC1-IR呈顯著負相關，r=-0.996 2，P<0.01。

圖1 Br組Eca-109細胞凋亡增加 TUNEL，×1000

圖2 Q組Eca-109細胞凋亡增加 TUNEL，×1000

圖3 （Br+Q）組Eca-109細胞凋亡顯著增加 TUNEL，×1000

圖4 C組Eca-109細胞凋亡很少見 TUNEL，×1000

表1 各組細胞Bcl-2、Bax、XRCC1-IR積分

2.4 各組免疫斑點印跡薄層色譜掃描數值 見表2。

表2 各組免疫斑點印跡掃描數值

2.5 各組Eca-109細胞的POLB-IR、MRP-IR表達及積分POLB-IR呈棕黃色顆粒，多位于胞核，也可見到有些細胞的整個細胞呈陽性反應。MRP-IR呈棕黃色顆粒主要位于細胞質。四個實驗組的免疫組化信號強弱的積分值見表3；MRP與POLB呈顯著正相關，r=0.983 8，P<0.01。

表3 各組細胞POLB、MRP-IR積分值

2.6 各組免疫斑點印跡薄層色譜掃描數值 POLB C組免疫斑點印跡薄層色譜掃描數值為109，Br組為72，Q組為25，（Br+Q）組為34；MRP C組免疫斑點印跡薄層色譜掃描數值為111，Br組為37，Q組為30，（Br+Q）組為54。

3 討 論

Bcl-2位于線粒體膜內層，可防止線粒體膜的非特異性滲透而提高ADP/ATP的交換[1]。前凋亡（pro-apoptotic）的Bax蛋白是Bcl-2家族成員之一，通過同源或異源二聚體調控線粒體功能和調控細胞凋亡。Bax·Bcl-2異二聚體抑制細胞凋亡，而Bax·Bax同源二聚體則促進細胞凋亡[2-5]。有報道Bcl-2/Bax的比例可預示急性髓性白血病（AML）預后的結果[2]。本實驗觀察到Eca-109對照組細胞Bcl-2-IR/Bax-IR的比值高約為4.3，在應用Br、Q或（Br+Q）處理后其比值下降分別為1.1、1.0和1.1，表明Bcl-2-IR/Bax-IR比值下降的改變可導致細胞凋亡。XRCC1是DNA修復蛋白，是DNA polβ聚合酶的異二聚體蛋白，對DNA單鏈斷裂損傷具有修復作用，修復蛋白覆蓋于DNA損傷處，可防止核酸酶的消化而具有抗細胞凋亡作用。本實驗中XRCC1-IR與Bcl-2-IR呈顯著正相關，二者與Bax-IR皆呈顯著負相關，這結果進一步表明XRCC1具有抗細胞凋亡作用，與Guo等[5]檢測正常肝和肝癌細胞的bax、bcl-2、bcl-XL的表達水平和相關性研究及這些凋亡相關蛋白對細胞凋亡的調節作用相似。本實驗應用Br和Q聯合誘導Eca-109細胞凋亡后bcl-2及XRCC1表達的下調，Bax表達的上調對該細胞凋亡起著調節作用；而且Br及Q的單獨和聯合用藥對Bcl-2-IR、Bax-IR或XRCC1-IR的影響無統計學差異，但細胞凋亡率，有統計學差異。該結果提示植物類黃酮的中藥與西藥聯合應用可能更具有臨床應用意義。

藥物耐藥性在臨床療效上是一個重要因素，已知wtp53與細胞凋亡和耐藥性密切相關，此外，調控蛋白如：Bcl-2和Bax等可能參與藥物耐藥性機制。有報道乳腺癌細胞系的凋亡與Bcl-2蛋白表達和Caspase-3活性有關，但與Bax和Bcl-Xs無關[6]。研究結果表明多藥耐藥性相關蛋白免疫反應性與Bcl-2-IR呈正相關，與Bax-IR呈負相關。提示：一方面Bcl-2與Bax可能皆參與Eca-109細胞的凋亡，另一方面前凋亡蛋白的Bax可能對8-Br-cAMP及槲皮素誘導凋亡藥物的敏感性較高，細胞的MRP表達減低。相反，Bcl-2可能對促凋亡誘導藥物的敏感性較低，有一定程度的耐藥性而提高MRP的表達。POLB主要是DNA損傷中最常見的DNA單核苷酸的切除修復酶，當高表達時，則對基因毒性藥物，如順鉑，敏感性降低而藥物耐藥性增高。有報道人卵巢癌細胞對順鉑耐藥的細胞比不耐藥的細胞POLB表達水平高3倍[7]；結腸癌細胞對順鉑等藥物耐藥性比對照的POLB表達高2.5倍[8]；類似報道也見于乳腺癌細胞[9]。本文結果表明 8-BrcAMP及槲皮素的聯合用藥可顯著降低不加藥的Eca-109細胞的POLB表達，同時也下調MDR表達。兩者之間呈顯著正相關，r=0.983 8，P<0.01。即降低了該細胞的藥物耐藥性，逆轉腫瘤惡性。槲皮素和8-Br-cAMP可抑制癌細胞周期進展和增殖，提高藥物敏感性，誘導食管癌細胞分化及凋亡，呈現不同信號轉導途徑的互補效應，提示其下調Eca-109細胞的增變基因表型。

[1]Belzacg AS,Vieira HL,Verrier F,et al.Bcl22 and Bax modulate adenine nucleotide translocase activity[J].Cancer Res,2003,63(2):541.

[2]Kanauchi H,Wada N,Clark OH,et al.Apoptosis regulatinggenes,bcl22 and bax,and human telomerase reverse transcriptase messenger RNA expression in adrenal tumors:possible and prognostic importance[J].Surgery,2002,132(6):1021.

[3]Thomas D,Yang H,Boffa DJ,et al.Proapoptotic Bax is hyperexpressed in isolated human islets compared with antiapoptotic Bcl22[J].Transplantation,2002,74(11):1489.

[4]Del Poeta G,Vendlttl A,Del Principe MI,et al.The amount of spontaneous apoptosis detected by bax/bcl22 ratio predicts outcome in acute myeloid leukemia(AML)[J].Blood,2003,102(2):2125.

[5]Guo XZ,Shao XD,Liu MP,et al.Effect of bax,bcl22 and bclxl on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol,2002,8(6):1059.

[6]yang XK,Zheng F Chen JH,et al.Relationship between expression of apoptosis-associated proteins and caspase-3 activity in cisplatin-resistant human ovarian cancer cell line[J].Ai Zheng,2002,21(12):1288.

[7]Valentinis B,Zaffaroni N,Sturani E,et al.Detection of DNA polymerase beta gene expression by competitive polymerasechain reaction in human ovarian carcinoma cells[J].Anticancer Res,1993,13(1):125.

[8]Funato T,Tone T,Miyachi,et al.Detection of drug resistant genes cisplatin-resistant colon carcinoma cells[J].Rinsho Byori,1993,41(1):95.

[9]Raaphorst GP,Cybulski SE,Sobel R,et al.The response of human breast tumor cell line with altered polymerase beta levels to cisplatin and radiation[J].Anticancer Res,2001,21(3B):2079.