溶菌酶和抗生素對肉雞組織IGF-ⅠmRNA的影響

武漢新華揚生物股份有限公司 程時軍 張 偉

華中農業大學動物營養系 馬立保*

胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）是機體發育中必不可少的生長激素（Daughaday和Rotwein，1989）。研究表明，IGF-Ⅰ主要由肝臟合成分泌，其在畜禽血液中的含量與體增重呈正相關（Beccavin等，2001），是促進肉雞生長的主要因子（Frank 等，1998）。 Hathaway 等（1996）報道，飼喂抗生素可使畜禽血清中的IGF-Ⅰ含量增加，從而促進畜禽生長。本試驗以溶菌酶替代抗生素使用，探討溶菌酶對肉雞體組織IGF-ⅠmRNA表達的影響，并簡要探討了溶菌酶可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 1日齡艾維因肉雞144只，購自武漢正大有限公司。

溶菌酶酶活性為500000 U/g，由武漢某公司提供，其酶活單位定義為：在25℃、pH為6.2的條件下，于450 nm處每分鐘引起溶酶小球菌體溶液吸光度下降0.001為1個酶活力單位（U）。

1.2 主要儀器及試劑 儀器：超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器有限公司）、組織樣本破碎機（Fast-Prep-24）、離心機（eppendorf centrifuge 5415R）、基因擴增儀（東勝創新EDC-810）、電泳儀（北京六一儀器廠DYY-7C型）、成像系統（AlphaImager EP）及實時 PCR 系統（Applied Biosystems 7500）。

試劑：TRIzol試劑、脫氧核（糖核）苷、DNA 多聚酶、AMV反轉錄酶、核糖核酸分解酶抑制劑、緩沖液、隨機引物，熒光定量PCR試劑盒（SYBR green，含ROX內參染料）。

1.3 試驗設計 采用單因子試驗設計，分4個處理組：（1）對照組，飼喂不含抗生素的基礎日糧；（2）抗生素組，飼喂含抗生素（有效成分為桿菌肽鋅和硫酸粘桿菌素，在日糧中的含量分別為20 mg/kg和4 mg/kg）的基礎日糧；（3）溶菌酶組1，飼喂含溶菌酶 150 mg/kg的基礎日糧；（4）溶菌酶組2，飼喂含溶菌酶300 mg/kg的基礎日糧。每組6重復，每重復6只，公母各半。試驗日糧參照NY/T 33-2004配制玉米-豆粕型粉料，各階段基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平

1.4 飼養管理 試驗于2008年11月20日至12月31日在湖北省飼料檢測站動物試驗房內進行，分0～21 d和22～42 d兩階段地面平養；室內溫度按飼養標準控制；在2～3周齡時以地克珠利飲水防球蟲病。免疫程序為：7 d用新城疫Lasota+傳染性支氣管炎H120二聯苗滴鼻、點眼；分別于14 d和21 d時IBD飲水。

1.5 樣品收集及處理 于42日齡清晨從各處理中隨機選取6只雞（每重復1只），翅靜脈采血，再屠宰取肝臟及一側胸肌各5 g左右用錫箔紙包好編號迅速置入液氮灌冷凍，轉到-80℃冰箱保存待用。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 RNA的提取 取適量組織于研缽加液氮研磨，再取 100 μL 研磨液，加入 500 μL TRIzol，室溫放置10 min，加入 100 μL氯仿，并劇烈振蕩5 s，室溫放置5 min。12000 r/min低溫離心15 min，取上清 200 μL，加 200 μL 異丙醇，冰盒上放置15 min。12000 r/min低溫離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌1次，低溫離心（8000 r/min，8 min）后棄上清液，風干后沉淀用DEPC水溶解，-80℃保存備用或立即進行反轉錄。

1.6.2 反轉錄反應 反轉錄反應體系見表2。反應程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min，1個循環，4℃結束。產物-20℃保存備用或立即進行RT-qPCR。

表2 反轉錄反應體系（10 μL）

1.6.3 引物設計、合成和檢測 本試驗用內參基因β-actin的引物參照馬莉等（2007）方法，用Primer-BLAST為IGF-Ⅰ設計引物，序列見表3。

表3 試驗用引物序列

1.6.4 熒光定量PCR反應 反應體系總體積為20 μL，待檢樣品和內參基因樣品均參照表4的反應體系進行。反應程序：95℃2 min，1個循環，然后95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 個循環。1.7 數據統計分析 試驗數據用平均數±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行ONE-WAYANOVA分析，并以LSD作多重比較。

表4 熒光定量PCR反應體系（20 μL）

2 結果與分析

溶菌酶對42 d肉雞肝臟和胸肌IGF-ⅠmRNA的影響結果見表5。

表5 溶菌酶對42日齡肉雞肝臟和胸肌IGF-ⅠmRNA的影響

從表5可以看出，抗生素組較對照組肝臟IGF-Ⅰ mRNA水平顯著提高了 18.8%（P＜0.05），2個溶菌酶組也較對照組分別提高12.5%和10.4%；2個溶菌酶組及抗生素組間差異不顯著（P＞0.05）；抗生素和2個溶菌酶組胸肌IGF-ⅠmRNA水平較對照組有提高的趨勢，但無顯著差異（P ＞ 0.05）。

3 討論

IGF-Ⅰ可以通過旁分泌及自分泌來參與促進機體的生長發育、營養代謝及肌細胞分化（Perrone，1995；Widmer 等 ，1985；Schmid 等 ，1983）。Beccavin等（2001）發現雞的生長速度與肝臟IGF-ⅠmRNA和血液IGF-Ⅰ水平相關。Duclos（2005）通過遺傳學和營養模型綜合分析得出的數據表明，決定旁分泌的IGF-Ⅰ水平的肌肉IGF-ⅠmRNA豐度和出生后雞的肌肉生長正相關。本試驗結果發現，與對照組相比，抗生素組、溶菌酶組1和溶菌酶組2可將肝臟IGF-Ⅰ mRNA水 平 分別 提 高 18.8%（P ＜ 0.05）、12.5%（P ＞0.05）和 10.4%（P ＞ 0.05），抗生素組和 2個溶菌酶組胸肌IGF-ⅠmRNA水平有提高的趨勢，但無顯著差異（P ＞ 0.05），這與 Beccavin 等（2001）及Duclos（2005）的研究結果類似。Hathaway等（1996）給斷奶豬飼喂抗生素ASP-250（四環素、磺胺甲嘧啶和青霉素的混合物）發現，血清IGF-Ⅰ濃度顯著高于對照組（P＜0.001），血清IGF-Ⅰ濃度提高24.8%的同時豬平均日增重提高26%，血清IGF-Ⅰ的受體IGFBP-3含量增加59%，推測使用抗生素影響IGF-Ⅰ從而促進豬生長。本試驗雖未檢測抗生素對IGF-Ⅰ及其受體含量的影響，但結果發現抗生素較對照組可顯著提高肉雞肝臟IGF-ⅠmRNA水平（P＜0.05），與上述報道類似。

另有報道稱肝臟IGF-Ⅰ基因受到生長激素（GH）、日糧能量及蛋白質濃度等因素調節（VandeHaar 等 ，1991；Emler 和 Schalch，1987；Roberts等，1986）。本試驗結果證明，除上述因素外，抗生素類物質也可影響肝臟IGF-Ⅰ基因表達，這也可能是其促生長機制之一。但溶菌酶是直接導致IGF-Ⅰ基因表達的提高，還是通過其他途徑間接導致IGF-Ⅰ基因表達改變從而影響動物生長后，具體作用機制還有待深入研究。

4 小結

日糧中添加150 mg/kg和300 mg/kg的溶菌酶可將42日齡肉雞肝臟IGF-ⅠmRNA水平較對照組分別提高12.5%和10.4%，但與對照組及抗生素組比較差異不顯著（P＞0.05）；其對胸肌IGF-ⅠmRNA水平也有提高趨勢（P＞0.05）。

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