枯草芽孢桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的理化性質(zhì)及抑菌譜的研究

徐海燕，張志焱，曹銀生，李美麗，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

近年來(lái)，由于抗生素的濫用，在食品中抗生素、藥物殘留及防腐劑添加超標(biāo)而導(dǎo)致的出口損失，已成為畜牧業(yè)發(fā)展的瓶頸。人們迫切需要探尋一種能取代抗生素的抗菌劑，于是細(xì)菌素成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

細(xì)菌素是細(xì)菌代謝過(guò)程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，具有抑制某些微生物生長(zhǎng)活性的作用[1-2]。細(xì)菌素是一種蛋白類物質(zhì)，可以被蛋白酶所降解，具有無(wú)抗藥性、無(wú)殘留、能夠抑制或殺死某些致病菌等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

枯草芽孢桿菌作為公認(rèn)的益生菌，其產(chǎn)生的細(xì)菌素在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中作為綠色飼料添加劑使用有著巨大的開發(fā)潛力。為此，本文初步分析了枯草芽孢桿菌Nxc6所產(chǎn)細(xì)菌素的理化性質(zhì)及其抑菌譜，以期為該細(xì)菌素在養(yǎng)殖業(yè)和其他領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌Nxc6由山東寶來(lái)利來(lái)生物研究院從牛糞中分離，經(jīng)數(shù)次傳代，抗菌活性穩(wěn)定。

指示菌：大腸桿菌O1、金黃色葡萄球菌等，由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物研究院保存。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌指示菌培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、進(jìn)口瓊脂1.5%、pH 7.0。

真菌指示菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

枯草芽孢桿菌Nxc6種子培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基。

枯草芽孢桿菌Nxc6發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、pH 6.5。

1.3 芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

從枯草芽孢桿菌Nxc6斜面上挑取一環(huán)至液體種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，然后以1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置500 mL三角瓶中，裝液量為100mL，37℃振蕩培養(yǎng)30 h，得到發(fā)酵液，待用。

1.4 產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

將發(fā)酵液3 000 rpm離心15 min，去除菌體得上清液，首先測(cè)定上清液中pH的變化，排除酸的影響，采用過(guò)氧化氫酶法進(jìn)行過(guò)氧化氫的檢測(cè)，以排除過(guò)氧化氫的干擾。然后緩慢的向上清液中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的硫酸銨進(jìn)行鹽析，4℃放置12 h使蛋白質(zhì)充分沉淀，5 000 rpm離心20 min，棄上清，將沉淀溶于原體積1/10的蒸餾水中，制成抗菌液，進(jìn)行抗菌活性的測(cè)定。

1.5 最佳硫酸銨濃度的選擇

將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于3 000 rpm離心15min去除菌體，上清液倒入8個(gè)250mL三角瓶中，每瓶100 mL，邊攪拌邊緩慢加入經(jīng)過(guò)研磨的無(wú)水硫酸銨粉末，使溶液的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，4℃放置8～12 h，使蛋白沉淀出來(lái)，13 500 rpm離心10min，棄上清，用蒸餾水將沉淀復(fù)溶，倒入透析袋中進(jìn)行流水透析（過(guò)夜）；分別測(cè)定8個(gè)濃度的上清液和透析液的抗菌活性，根據(jù)抑菌圈的大小確定硫酸銨的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.6 細(xì)菌素抗菌活性的檢測(cè)

細(xì)菌素抗菌活性的檢測(cè)采用牛津杯法。雙碟的制備：取直徑90 mm的培養(yǎng)皿，注入滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂（1.5%）15mL，水平放置使之凝固，作為底層，取指示菌培養(yǎng)基（濃度為0.8%，冷卻至50℃）與指示菌菌液適量混勻，取6 mL鋪在底層培養(yǎng)基上，水平放置使之凝固，作為菌層。

用無(wú)菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開皿蓋，放在培養(yǎng)基上。在牛津杯中加滿相同量的抗菌液（300μL），每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。將加完樣的培養(yǎng)皿小心放入37℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18 h后（其中以真菌做指示菌的培養(yǎng)時(shí)間為30℃、3 d）取出測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 枯草芽孢桿菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性質(zhì)研究

溫度穩(wěn)定性：分別取5mL透析液于9支試管中，在20、40、60、80和100℃ 下處理 10、30和60min，冷卻后檢測(cè)其抗菌活性。

pH的穩(wěn)定性：分別取5 mL透析液于8支試管中，用 4mol·L－1的鹽酸或 4mol·L－1的氫氧化鈉溶液將發(fā)酵上清液pH調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，室溫下保持24 h后將各管的pH調(diào)回7.5，檢測(cè)其抗菌活性。

蛋白酶穩(wěn)定性：將透析液分別與胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶混合，使酶的終濃度為0.5 mg·mL－1，在各種酶的最適溫度、最適pH下作用2 h，反應(yīng)結(jié)束后將混合液的pH調(diào)回7.5，檢測(cè)其抗菌活性。

1.8 抑菌譜的測(cè)定

抗細(xì)菌活性試驗(yàn)采用牛津杯法，同1.6。

孢子懸液的制備：向培養(yǎng)好的真菌斜面上注入5 mL無(wú)菌生理鹽水，洗下孢子制成菌懸液（含107孢子·mL－1）。雙碟的制備以及加樣品同1.6，其中菌層指示菌為真菌孢子懸液。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

微生物發(fā)酵后能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如：脂肪酸、氨等，枯草芽孢桿菌Nxc6經(jīng)發(fā)酵后，其發(fā)酵液的pH為7.5，故可排除酸堿抗菌的影響，并且其上清液有明顯的抑菌活性。其上清液經(jīng)硫酸銨沉淀后表現(xiàn)出更加明顯的抗菌活性，見表1。

因此，可以認(rèn)為枯草芽孢桿菌Nxc6所表現(xiàn)出來(lái)的抗菌活性主要是蛋白類物質(zhì)，即細(xì)菌素類物質(zhì)。

表1 產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定mm

2.2 最佳硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)沉淀結(jié)果（以抑菌圈直徑表示）見表2。

表2 不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)沉淀結(jié)果 mm

從表2可以看出，硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～40%時(shí)，透析液的抑菌活性處于較高的平臺(tái)期，這一階段是比較穩(wěn)定的，并且硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)上清液的抑菌活性處于較低的水平，說(shuō)明細(xì)菌素的分離是比較完全的。雖然質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)硫酸銨沉淀出的細(xì)菌素與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%沉淀產(chǎn)生的細(xì)菌素的抗菌活性大體相同，但是進(jìn)一步增加硫酸銨的濃度，只能析出雜蛋白，對(duì)抗菌活性無(wú)顯著的影響，因此硫酸銨沉淀的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。

2.3 枯草芽孢桿菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性質(zhì)研究

2.3.1 溫度穩(wěn)定性

不同溫度和處理時(shí)間對(duì)細(xì)菌素活性的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)細(xì)菌素活性的影響

從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌Nxc6所產(chǎn)生的細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性。對(duì)金黃色葡萄球菌而言，在20、40、60、100℃處理30min，活性基本沒什么變化，只是在80℃處理60min時(shí)，活性出現(xiàn)了小幅的下降。對(duì)大腸桿菌而言，在20、40、60、100℃處理10min，活性沒有較大的波動(dòng)，只是在80℃處理30～60 min時(shí)，活性出現(xiàn)了小幅的下降?？莶菅挎邨U菌Nxc6所產(chǎn)細(xì)菌素的這種熱穩(wěn)定性為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2.3.2 pH的穩(wěn)定性

不同pH對(duì)細(xì)菌素活性的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同pH對(duì)細(xì)菌素活性的影響

從圖2可以看出，對(duì)金黃色葡萄球菌而言，pH為10.0～11.0時(shí)的抗菌活性下降較為明顯，但仍保持在較高的水平；對(duì)大腸桿菌O1而言，pH為11.0時(shí)的抗菌活性稍有下降?？梢娍莶菅挎邨U菌Nxc6產(chǎn)生的細(xì)菌素在弱酸、中性以及堿性環(huán)境中有很好的穩(wěn)定性。

2.3.3 蛋白酶穩(wěn)定性

蛋白酶對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白酶對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響

從圖3可以看出，枯草芽孢桿菌Nxc6發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)幾種蛋白酶處理后，抗菌活性明顯降低，但仍具有一定的活性，尤其是對(duì)胰蛋白酶最為敏感，這一結(jié)果表明了該細(xì)菌素是蛋白類物質(zhì)。

2.4 細(xì)菌素的抑菌譜測(cè)定

2.4.1 細(xì)菌素對(duì)各種細(xì)菌的抑菌譜

細(xì)菌素對(duì)各種細(xì)菌的抑菌譜結(jié)果見表3。由表3可知，該細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的抑制作用，表明其是一種比較廣譜抗菌的細(xì)菌素。

表3 細(xì)菌素對(duì)各種細(xì)菌的抑制作用 mm

2.4.2 細(xì)菌素對(duì)各種真菌的抑菌譜

細(xì)菌素對(duì)各種細(xì)菌的抑制作用結(jié)果見表4。

由表4可知，該細(xì)菌素對(duì)部分真菌有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)部分真菌則無(wú)抑制作用。

表4 細(xì)菌素對(duì)各種細(xì)菌的抑制作用mm

3 結(jié)論

研究表明，枯草芽孢桿菌Nxc6所產(chǎn)細(xì)菌素具有較強(qiáng)的抑菌效果，且具有很好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，在pH為8.0時(shí)抑菌活性最大，胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶均可使該細(xì)菌素部分失活。

枯草芽孢桿菌Nxc6所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜較寬，對(duì)畜牧業(yè)及食品污染中常見的致病微生物金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及對(duì)引起農(nóng)作物患病的腐敗菌（如白葉枯病菌）有明顯的抑制作用，因此枯草芽孢桿菌Nxc6所產(chǎn)細(xì)菌素在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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