西南樺遺傳多樣性研究

董 蔚，黃壽先，陳 榮，桂仁意

（1. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 廣西大學 林學院，廣西 南寧 530004）

西南樺遺傳多樣性研究

董 蔚1，黃壽先2，陳 榮1，桂仁意1

（1. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 廣西大學 林學院，廣西 南寧 530004）

摘要：采用改良CATB法對采自云南大青山、平果等9個天然分布區的150個西南樺（Betula alnoides）樣品進行DNA提取，獲得了較高質量的DNA，然后利用AFLP分子標記技術，建立了適用于西南樺的AFLP反應體系；選擇5對AFLP引物，對150個西南樺樣品進行擴增，共檢測出158個位點，其中多態性位點115個，占72.8%，每對引物獲得20～55個位點，多態性比例為50.0%～84.0%。通過對西南樺的遺傳多樣性分析，結果表明：在種間個體水平上，多態性位點百分率為76.58%～93.04%，平均為83.8%；在群居水平上，多態性位點百分率為72.80%。可見西南樺天然居群內的變異大于居群間的變異；由Nei’s遺傳距離分析得出，西南樺大部分居群間還是存在一定的遺傳距離，其中最大在東蘭和靖南之間，為0.020 1。

關鍵詞：西南樺；遺傳多樣性；分子標記；AFLP；多態性

西南樺（Betula alnoides）為樺木科樺木屬在北半球分布最南的一個種，集中分布在云南、廣西和貴州南部地區，該分布區與越南、老撾和緬甸的分布區連成一片，形成西南樺中心分布區，垂直海拔200～2 800 m[1～2]。西南樺為強陽性樹種，喜光，不耐蔭蔽，適生于酸性土壤，具一定的耐貧瘠能力。西南樺生長迅速，是繼桉樹后又一優良速生珍貴樹種，與陰性或中性偏蔭樹種紅椎、木荷、樟樹等混交成林，不僅生長好而且林分結構好，防護性能強，生態效果好[3～5]。

西南樺生態、經濟價值高，屬旱季落葉樹種，保持水土能力強；林內VA菌等微生物可改良土壤，為改造熱帶、亞熱帶地區生態公益林的理想樹種。西南樺樹干通直圓滿，木材密度適中、紋理優美、不翹不裂極易于加工，被廣泛應用于高級建筑裝飾及高檔家具制作。在廣西百色，西南樺原木山場價便高達1 700元/m3。西南樺樹汁營養豐富，可開發樺樹汁作為飲料；樹皮鞣質含量為7.0%～11.6%，可用于提制栲膠[3～4]。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南大青山、平果等9個西南樺天然分布區采集樣本，每個樣本間隔50 m以上，挑選新鮮無病蟲害完整葉片放入封口袋中，加變性硅膠干燥后帶回實驗室常溫保存[6～7]。共采集9個居群150個單株（表1）。

表1 西南樺采樣情況Table 1 Sampling ofB. alnoides

1.2 方法

1.2.1 模板制備 參照李志真等[8]的改良CTAB法抽提基因組DNA，使用紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并稀釋到100 ng/μL備用。

1.2.2 AFLP分析 參照Vos等[9]的方法進行AFLP試驗。基因組DNA用EcoRI和MseI雙酶后，進行相應的接頭連接，使用帶一個選擇性堿基的引物進行預擴，預擴產物稀釋20倍作為選擴模板。經引物篩選，以擴增條帶數目適中、多態位點比例高的5對引物組合（表2）進行選擴，并用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳并銀染顯帶。

表2 引物組合選擇及序列Table 2 Selection of primer combination and the sequence

1.3 數據分析

根據電泳結果，讀取100～800 bp中清晰的條帶，將每個條帶視為一個位點，有帶記為“1”，無帶計為“0”，建立二元數據矩陣，進行統計和計算。用AFLP_SURV1.0分析軟件對統計結果進行分析，根據Nei等[10]計算遺傳相似系數和遺傳距離。

式中，GS為遺傳相似系數，Nij為個體i和j的共有位點，Ni＋Nj為總位點數，GD為遺傳距離，當GD為1時表明遺傳距離最遠，當GD為0時表明遺傳關系最近。

表3 擴增結果統計Table 3 Statistics of AFLP amplified

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增結果

選用的5對引物組合共擴增出158條清晰有效條帶，每對引物的擴增信息見表3。根據這158條AFLP標記條帶進行西南樺的遺傳多樣性分析，各居群間多態性位點數、多態位點百分率以及基因多樣性見表4。

從表4可以看出，云南西南樺各居群內的多態位點百分率為76.58%～93.04%，F居群的多態位點百分率最低，為76.58%，I居群的多態位點百分率最高，為93.04%，9個居群多態位點百分率平均為83.8%。根據多態位點百分率大小對9個西南樺居群進行排序為：I > G > C > A > B > D > E > H > F。

表4 西南樺群居遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of communities ofB. alnoides

Nei’s基因多樣性分析結果則在0.209 8～0.284 0，F居群最低為0.209 8，I居群最高為0.284 0。9個居群Nei’s基因多樣性分析結果由大到小排序為：I > C > G > A > B > D > H > E > F。

表5 Nei’s遺傳距離Table 5 Nei’s genetic distance

在群居水平上，多態性位點共115個，占72.80%。由此可見，西南樺在群居間的遺傳多樣性低于居群內的遺傳多樣性，具一定的地域遺傳變異。Nei’s基因多樣性分析結果為0.244 2，為居群內數值的平均值。

2.2 群體間遺傳結構

9個西南樺天然群體遺傳距離見表5，大青山與靖南、田林，平果與田林、東蘭，那坡與靖南、田林，天峨與東蘭，靖南與東蘭之間的遺傳距離均超過了0.010 0，其中靖南與東蘭遺傳距離最大，為0.020 1。

3 討論

由于西南樺天然林分布區地理位置偏僻，分布面積廣，樣品采集困難[11]；并且樺木屬植物中富含多糖和多酚類物質，不利于DNA提取[8]；同時，從分子水平對西南樺遺傳多樣性進行分析尚未見報道。因此本試驗通過AFLP分子標記對廣西區西南樺天然林進行遺傳多樣性分析，結果表明，9個天然群體多態位點百分率為76.58%～93.04%，平均值為84.05%，明顯高于居群間水平，同時群體內的遺傳多樣性和基因多樣性也高于群體間水平。說明西南樺遺傳多樣性豐富，且不同天然分布區之間遺傳變異不大。

西南樺的居群內的遺傳多樣性較居群間水平豐富，可能有以下幾個原因引起：①曾杰等[11～12]認為盡管由于不適宜生境的阻隔以及森林破碎化導致西南樺居群之間存在一定程度的隔離，但它們是風媒植物，相互之間仍然存在較強的基因流，從而減少了遺傳漂變；②根據葛錦芳等[13]的推測，廣西壯族自治區的西南樺是從云南沿著南盤江擴散而來，居群分化的歷史較短，所以居群間分化較小；③西南樺的大規模采伐始于20世紀80年代，由于時間較短，所導致的生境破碎化對西南樺天然居群的遺傳變異尚無顯著影響；④本研究的調查范圍僅限于廣西壯族自治區，而且西南樺只在其西南部、西部和西北部有分布，其經度、緯度和海拔跨度較小。

西南樺遺傳多樣性的研究對開展其良種選育、種質資源保存以及天然林防護和經營具有重要意義[11～12]。因此，應加強現有群體的遺傳多樣性保護及基因交流，以防遺傳多樣性縮小或喪失。同時，挑選基因多樣性高的居群作為遺傳資源收集與保存。西南樺分布較為廣泛，有效保護和合理經營遺傳多樣性豐富的居群有助于適應環境變化。

參考文獻：

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[13] 葛錦芳. 云南樺木科植物的分類與地理分布[J]. 西南林學院學報，1985（1）：1－9.

中圖分類號：S792.159

文獻標識碼：A

文章編號：1001-3776（2010）04-0050-03

收稿日期：2010-03-10；修回日期：2010-05-05

基金項目：廣西大學中南速生材繁育實驗室開放研究課題“廣西區西南樺遺傳多樣性研究”（KF(2004)-004）

作者簡介：董蔚（1984－），男，浙江臨安人，碩士，從事林木生物技術研究。

Research on Genetic Diversity of Betula alnoides

DONG Wei1，HUANG Shou-xian2，CHEN Rong1，GUI Ren-yi1
（1. State Key Laboratory Cultivation Base of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Forestry College, Guangxi University, Nanning 530004, China）

Abstract:Extraction of DNA was conducted by improved CATB from 150 samples ofBetula alnoidesat 9 natural communities in Daqingshan, Pingguo, etc. Yunnan province. And AFLP reaction system was established by AFLP molecular marker. Five EcoRI/MseI primer combinations were selected and amplified 158 clear bands, among them 115 bands of polymorphic, taking 72.8%. Each primer enzyme mix amplified 20-55 bands, 50.0%-84.0% of them polymorphic bands. Analysis on genetic diversity showed that interspecific percentage of polymorphic loci was 76.58%-93.04%, average 84.05%, community percentage of polymorphic loci was 72.80%, indicating that more variation in community than that among communities. Analysis of Nei’s showed that there is significant genetic distance among most natural communities ofB. alnoides. The biggest is 0.0201 between Donglan and Jingnan.

Key words:Betula alnoides; genetic diversity; molecular marker; AFLP; polymophic