景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間親緣關系與遺傳基礎研究

蔣燕鋒，劉 饒，斯金平*

（1. 浙江林學院 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2. 浙江省景寧縣科技開發服務部，浙江 景寧 323500）

景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間親緣關系與遺傳基礎研究

蔣燕鋒1，劉 饒2，斯金平1*

（1. 浙江林學院 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2. 浙江省景寧縣科技開發服務部，浙江 景寧 323500）

采用ISSR（Inter simple sequence repeat）分子標記研究景寧木蘭（Magnolia sinostellata）與17個木蘭科木蘭屬其它植物之間的親緣關系，揭示景寧木蘭的遺傳基礎。在本試驗條件下，從120個ISSR引物中篩選出20個具有多態性的引物，共檢測到178條清晰的條帶，其中163條具有多態性，占91.60%。通過POPGENE 32軟件分析，除了木蘭亞屬的山玉蘭獨自成一類外，符合赫欽生的木蘭屬分類系統：厚樸、廣玉蘭及其變種為木蘭亞屬一類，其余包括景寧木蘭、天目木蘭、武當木蘭等為玉蘭亞屬一類；玉蘭與辛夷的雜交種二喬木蘭與辛夷的遺傳距離最近，為0.231 4，與玉蘭的遺傳距離也只有0.316 7；木蘭屬內遺傳距離最近的為天目木蘭與日本辛夷，為2.232 1，遺傳距離最遠的為山玉蘭與日本辛夷，為0.736 9；景寧木蘭與本屬其它植物間的遺傳距離在0.278 2 ～ 0.610 9，其中與天目木蘭的遺傳距離最近，為0.278 2，與山玉蘭的遺傳距離最遠，為0.610 9。這表明景寧木蘭具有其特有的遺傳基礎，且與天目木蘭親緣關系最近。

景寧木蘭；ISSR；遺傳關系

景寧木蘭（Magnolia sinostellata）是1984年發現、1989年定名的木蘭屬新種[1～2]，原分布區十分狹窄，至今僅在浙江省景寧畬族自治縣東坑鎮大張坑村與景寧林業總場草魚塘林場交界處（29.9° N、119.6° E）發現有自然分布，整個分布區約25 hm2，集中分布區僅0.2 hm2，種群數量少，剛發現時約有120株（叢），因該種具有較高的觀賞價值，后因一些個體木蘭園和養花愛好者盲目亂挖，現存野生植株約60株（叢），使該種剛剛發現就瀕臨滅絕。景寧木蘭的資源現狀及保護價值[3]在第一屆國際木蘭大會交流后引起有關專家的高度重視，被大會列為最有閃光點的報告之一[4]。浙江省也將該種列入珍稀瀕危植物名錄。本文采用ISSR[5]（Inter simple sequence repeat）分子標記技術研究景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間的親緣關系，揭示景寧木蘭的遺傳基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為植物嫩芽。于杭州植物園采集17種木蘭科木蘭屬植物以及浙江景寧林業總場草魚塘林場的景寧木蘭嫩葉（表1），用硅膠干燥，－70℃冰箱存放備用。

表1 實驗材料Table 1 Test material

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）—硅珠吸附法提取植物基因組DNA[6]，用NanoDrop微量分光光度計（ND-1000）測定DNA的純度和濃度。同時每個樣品取5μL，加1μL上樣緩沖液混合后，于0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測[6]，在凝膠成像系統（Gel DocTM，Bio-Rad）下觀察并照相。

1.2.2 PCR擴增 擴增體系參考陳亮明等廣玉蘭ISSR-PCR反應體系[7]，20μL體系：50 ng DNA模板，0.5μmol/L ISSR引物，100.0μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L氯化鎂，1U Taq DNA聚合酶，10×PCR反應緩沖液。PCR反應程序：94℃預變性5.0min；94℃變性30 s，引物最適退火溫度退火40 s；72℃延伸50 s，35個循環；72℃延伸5.0 min。PCR擴增產物于10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測并于凝膠成像系統拍照分析。本實驗在Perkin-Elmer 9700（PE9700）擴增儀上進行。

1.2.3 引物篩選 所用ISSR引物參考加拿大UBC大學提供的引物序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物先用一個模板DNA從100個ISSR引物中初篩。然后用4個模板DNA進行復篩，篩選出條帶清晰而且具有多態性的引物，用于正式的PCR擴增[8]。

1.2.4 數據統計與分析 同一引物，同一位點，根據擴增產物的有（1）無（0）得到二元資料，形成0,1矩陣。用POPGENE32軟件[9]進行分析，計算遺傳相似系數，運用UPMGA法構建樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA結果檢測與分析

獲取高質量的基因組DNA是實驗成功的關鍵步驟之一。本實驗采用CTAB—硅珠法從植物嫩芽中提取模板DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現條帶十分清晰而且明亮無拖尾、背景干擾等現象，表明蛋白質等雜質去除較干凈，純度較高，經測定260/280比值在1.8左右，其濃度、純度均符合實驗要求。

2.2 ISSR引物篩選分析

隨機用1個樣品對120個引物進行篩選，結果有較多引物都有擴增，每個引物可擴增出1 ～ 15條帶不等；再次對條帶清晰、主帶明顯的初篩引物進行篩選，最終選用的20個引物（見表2）反應穩定、擴增性強和重復性好。

2.3 ISSR多態性分析

篩選出的20個引物共檢測到178條帶，平均每條引物擴增出8.9條帶，ISSR擴增片段大約集中在300 ～ 1 500 bp。其中163條帶表現為多態性，占總條帶數的91.6%。擴增出條帶最多的引物為809，共12條；條帶最少的是引物807；多態性最高的是引物899，多態率高達100%（表2）。圖1是引物810擴增的結果。

圖1 引物810擴增結果Figure 1 Amplification result with primer of 810

表2 引物序列及其擴增結果Table 2 Primer sequence and amplification result

2.4 遺傳距離聚類分析

利用聚類分析軟件 POPGENE 32對ISSR-PCR擴增所得的多態性位點進行分析，計算得到17個樣品的Nei’s遺傳距離[10]及遺傳相似矩陣（圖2）。從聚類結果可以看出，17個樣本在系數為0.6左右明顯可分為3類：第一類僅有山玉蘭；第二類由厚樸及其變種凹葉厚樸和廣玉蘭及其變種狹葉荷花玉蘭組成；第三類則包含景寧木蘭、天目木蘭、日本辛夷、寶華玉蘭及其余的木蘭科植物。

圖2 木蘭科植物遺傳聚類圖Figure 2 Dedrogram of 17 species of Magnolia

與形態學分類對比分析，除了木蘭亞屬的山玉蘭獨自成一類外，符合赫欽生的木蘭屬分類系統：厚樸、廣玉蘭及其變種為木蘭亞屬一類，其余包括景寧木蘭、天目木蘭、武當木蘭等為玉蘭亞屬一類；玉蘭與辛夷的雜交種二喬木蘭與辛夷的遺傳距離最近，為0.231 4，與玉蘭的遺傳距離也只有0.316 7。木蘭屬內遺傳距離最近的為天目木蘭與日本辛夷，為0.232 1，遺傳距離最遠的為山玉蘭與日本辛夷，為0.736 9。景寧木蘭與本屬其它植物間的遺傳距離在0.278 2 ～ 0.610 9，其中與天目木蘭的遺傳距離最近，為0.278 2，與山玉蘭的遺傳距離最遠，為0.610 9。表明景寧木蘭具有其特有的遺傳基礎，且與天目木蘭親緣關系最近。

3 討論

景寧木蘭喜溫暖濕潤、水分充足的環境，其樹形呈灌木狀，叢生，葉片較小，特別是花被輪多數、花被片數量多，顏色紫紅色至淡紅色，且株間存在較大差異，花被片倒披針形或倒卵狀匙形，不僅具有直接園藝開發的價值，而且具有木蘭科植物間雜交、景寧木蘭自身誘變育種等諸多方面的價值。

分子標記技術用于種質鑒定具有不受栽培環境影響的優勢，對珍貴瀕危的景寧木蘭的遺傳結構和遺傳地位的研究具有非常重要的意義。

本研究運用ISSR分子標記技術對景寧木蘭與其它17種木蘭屬植物的遺傳結構研究表明，木蘭屬內各植物之間具有較大的遺傳差異，遺傳基礎較寬。厚樸及其變種凹葉厚樸和廣玉蘭及其變種狹葉荷花玉蘭之間遺傳距離較近；二喬木蘭、辛夷（紫玉蘭）和玉蘭三者間的遺傳距離也比較近，這與其形態特征的相似相對應，特別是二喬木蘭，是辛夷與玉蘭的雜交種。相比之下，景寧木蘭與山玉蘭的遺傳距離最遠，親緣關系較遠，而與天目木蘭的遺傳距離最近，親緣關系也最近。

[1] 裘寶林，陳征海. 浙江木蘭屬新種[J]. 植物分類學報，1989，27（1）：79－80.

[2] 斯金平，蔡通愛. 珍稀瀕危植物景寧木蘭[J]. 浙江林業科技，1998，18（1）：68－71.

[3] SI Jin-ping. Protection and Development of Magnolia sinostellata[A]. Proceedings of the International Symposium on the Family Magnoliaceae[C]. Beijing：Science Press，2000. 272－273.

[4] Richard B Figlar. South China: Its Magnolias and the 1998 Intermational Symposium on the Family Magnoliaceae[J]. MAGNOLIA, 1999（66）：1－17.

[5] Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (ISSR)anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994（20）：176－183.

[6] Assefa K，Merker A，Teffera H. Inter simple sequence repeat (ISSR) analysis of genetic diversity in tef (Eragrostistef (Zucc.) Trotter). Hereditas，2003（139）：174－183.

[6] Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989. [7] 陳亮明，相陽，張冬林，等. 兩種方法對廣玉蘭ISSR-PCR反應體系的優化比較[J]. 種子，2008，27（6）：10－14.

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[10] Nei M，Li W H. Mathematical models for studding genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Nat Acad Sci USA，1979（76）：5 269－5 273.

Study on Genetic Relation among Magnolia sinostellata and Other Species of Magnolia

JIANG Yan-feng1，LIU Rao2，SI Jin-ping1
（1. School of Forestry and Biological Technology, Zhejiang Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. Jingning Science and Technology Extension Station of Zhejiang, Jingning 323500, China）

Study was conducted on genetic relation among Magnolia sinostellata and other 16 species of Magnolia by inter simple sequence repeat (ISSR). 20 polymorphism primers were selected from 120 primers, and 193 bands were detected, of which 160 polymorphism. POPGENE 32 was used to calculate the genetic distance among these plants. Result showed that the polymorphism ratio was 82.90%, and the distance between M. sinostellata and other Magnolia ranged from 0.278 2 ( M. amoena) to 0.610 9(M. delavayi).Unweighted pair-group mean analysis (UPGMA) grouped them into three clusters: M. amoerna; M. officinalis, M. grandiflora and their varieties; M. sinostellata, M. amoena, M. sprengeri and so on. The results suggested that M. sinostellata had close genetic relation with M. amoena, M. kobus and M. zenii.

Magnolia sinostellata; ISSR; genetic relation

S718.3

1001-3776（2010）02-0022-04

2009-11-20；

2010-02-08

浙江省重大科技計劃項目（2005C32052）

蔣燕鋒（1984－），男，浙江嘉興人，碩士研究生，從事藥用植物遺傳研究；*通訊作者。