3H11的123I標記及其生物分布

秦紅斌,尹 衛,高惠波,陳大明,楊 志,祁本忠,金小海,白紅升,張文輝

(1.原子高科股份有限公司,北京 102413;2.北京大學臨床腫瘤學院,北京腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫學科,北京 100036)

123I由于其優良的核素性質:發射159 keV的單能γ射線,適于SPECT顯像;半衰期只有13.2 h,可以降低對患者與工作人員的輻射損害[1],而成為放射性藥物研制中理想的核素之一。123I系高能加速器生產核素,以前在國內應用受到一定限制,但隨著高能加速器的市場化,123I的獲取更方便,使123I系列藥物逐漸成為當今前瞻性診斷藥物研究的重要發展方向之一。單克隆抗體能識別特異抗原并與之結合,尤其能識別腫瘤抗原,單抗3H11與胃癌組織具有高陽性反應率、高選擇性及高親和力的特點,受到很多學者的廣泛關注。

目前用于 3H11標記的核素主要有125I、131I、211At 、188Re、90Y 等,標記物主要用于胃癌顯像或治療評價[2-9]。國內用123I標記單克隆抗體顯像的報道很少,也沒有用123I標記胃癌抗克隆抗體3H 11的報道。本研究擬以123I作為顯像核素標記單克隆抗體3H 11(McAb 3H 11),并對123I-3H11在正常鼠體內的生物分布進行觀察,探討該標記物作為診斷胃癌及胃癌轉移灶顯像劑的可能性。

1 主要實驗材料

1.1 主要儀器

FT-603井型γ閃爍探頭-FH463A智能定標儀:北京核儀器廠產品;AR2130型電子天平:美國OHAUS公司產品;單道可調移液器:美國Eppendorf公司產品;PD-10柱:瑞典 GE Healthcare公司產品;Whatman No.1試紙:英國Whatman公司產品。

1.2 主要試劑

小鼠單克隆抗體3H 11:北京腫瘤研究所惠贈;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA):北京博奧森生物技術有限公司產品;Na123I溶液:放射性濃度為 665 GBq/L,原子高科股份有限公司產品。其余試劑均為分析純,購自北京化學試劑公司。

1.3 實驗動物

正常昆明小鼠:15只,雌性,6～8周齡,體重18～22 g,SPF級,購自北京維科利華公司。

2 實驗方法

2.1 123I-3H11標記

采用 Iodogen法對 3H 11抗體進行123I標記。在底部涂敷10μg Iodogen的塑料小管中加入100μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、30μL 3H11(1 g/L溶于p H7.4 PBS中)、20μL約13.3 MBq的Na123I,以pH 7.4 PBS控制反應總體積為150μL,室溫下不間斷勻速震蕩反應8 min。將液體取出終止反應,加入100μL 0.01 mol/L PBS蕩洗反應管,并將洗滌液合并入反應液中。

2.2 標記率的測定

采用薄層層析法分析標記率。以Whatman No.1試紙為支持體,用 V(甲醇)∶V(水)=85∶15為展開劑。根據所得R f計算標記率。

2.3 123I-3H11的純化

標記產物采用PD-10柱純化,用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)淋洗。PD-10柱流速要求1 mL(20滴)/min,每分鐘接一管,測量各管放射性活度。采用2.2節測標記率的方法測123I-3H11放化純度。

2.4 123I-3H11的體外穩定性

取50μL純化后的標記物分別加入到100μL以下 3種體系中:生理鹽水、PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)、人血清。以下三種環境:4 ℃、室溫 、水浴37 ℃下貯存,分別于2、24、48 h取樣,紙色層測定放化純度,觀察標記物的穩定性。

2.5 123I-3H11在小鼠體內的生物學分布

選用雌性昆明小白鼠15只,隨機分為3組,每組5只。經尾靜脈注射0.1 mL123I-3H11(約1.11 MBq,比活度 40 GBq/g),于注射后 2、24、48 h眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。取心、肝、脾 、肺 、腎 、胃 、腸 、肌肉 、骨 、甲狀腺等組織稱重并測量其放射性計數。經衰變校正后,計算每克臟器的放射性攝取占總注射劑量的百分數(%ID/g)。

3 結果與討論

3.1 123I-3H11標記條件的優化

3.1.1 Na123I活度對標記率的影響 2.1節中,僅改變反應體系中Na123I活度,觀察其對123I-3H11標記率的影響,結果示于圖1。由圖1可以看出,隨Na123I放射性濃度的增大,標記率呈下降趨勢,2.3 MBq時最大,為92%;9.5和13.3 MBq時,標記率約 80%。為保證所合成的123I-3H 11能達到一定的比活度,參與反應的Na123I放射性活度不應太小。本實驗選用13.3 MBq。

圖1 反應體系中Na123 I放射性濃度對標記率的影響

3.1.2 氧化劑Iodogen用量對標記率的影響僅改變2.1節中氧化劑用量,觀察其對標記率的影響,結果示于圖2。圖2表明,氧化劑Iodogen量小于10μg時,標記率隨Iodogen量的增加而增大,但Iodogen用量太少,其氧化能力不夠,不能使I-被充分氧化成I+;而在Iodogen用量大于40μg后,標記率隨Iodogen用量的增加而降低,這主要是由于Iodogen量太多,氧化能力過強,產生高價態的碘,導致標記率減小。因此,選擇 Iodogen用量為 10μg。

圖2 Iodogen用量對標記率的影響

3.1.3 緩沖溶液pH對標記率的影響 2.1節中,改變緩沖溶液p H,其它條件保持不變,觀察p H對標記率的影響,結果示于圖3。由圖3可知,p H對標記率有一定的影響,緩沖溶液pH為7.4～7.6時標記率最高,約為80%。因此,選擇緩沖液的p H為7.4。

圖3 緩沖溶液p H對標記率的影響

3.1.4 標記反應時間的選擇 按2.1節方法制備123I-3H11,在不同時間點測標記率,結果示于圖4。由圖4可知,反應 5 min,標記率達到72%;繼續反應到8 min時,標記率達到76%;此后隨時間延長,標記率不再有明顯變化。反應時間延長對標記率有一定的貢獻,但會使單抗的活性降低。因此,選擇標記時間8 min。

3.1.5 反應體積對標記率的影響 改變2.1節中反應液的體積,觀察其對標記率的影響,結果示于圖5。由圖 5可知,反應體積為50、150、1 000μL時,標記率分別為 95.1%、89.3%、42.1%。該結果表明,碘化反應標記率與反應體積有關,增大反應體積,標記率呈下降趨勢。這是由于反應體積小時,被氧化的123I-與單克隆抗體結合的概率大,標記率高。但反應體積小時有一個缺點,即重現性差。原因可能是,每支反應管中涂層Iodogen位置有差異,反應液體積過小,不能全部蓋過涂層,使得每次反應中實際參加的氧化劑量不同,氧化的123I-的量也不同,導致標記率重現性差。但反應體積過大,使單克隆抗體的濃度被稀釋,氧化后123I與抗體的取代反應機率變小,標記率低。綜合考慮后,選擇反應體積為150μL。

圖4 反應時間對標記率的影響

圖5 反應體積對標記率的影響

3.1.6 反應溫度對標記率的影響 在2.1節方法中,改變反應溫度,其它條件不變,觀察反應溫度對標記率的影響,結果示于圖6。從圖6中可以看出,反應溫度為0℃時,標記率為70%;反應溫度為10～20℃時,標記率為73%±2%;反應溫度升高到30℃,標記率增加到78%。溫度較高易使單克隆抗體的活性下降,因此,選擇標記反應在室溫下進行。

3.2 最佳條件下的標記

根據上述條件實驗,選擇最佳標記條件為:Iodogen 10 μg、PBS 的 p H 7.4、單抗 3H 11 30 μg、123I活度 13.3 MBq、反應時間 8 min、室溫、總反應體積150μL。在最佳條件下制備標記物,采用薄層層析法分析標記物,123I-3H 11的R f為 0.0～ 0.1;游離碘的R f為 0.7～ 0.9;標記率78.9%;PD-10柱純化后放化純度為96.4%。

圖6 溫度對標記率的影響

3.3 123I-3H11的體外穩定性

123I-3H 11在不同體系中、不同溫度下的穩定性分別示于圖7和圖8。由圖7可以看出,標記物在人血清、生理鹽水和pH 7.4的PBS三種體系中,4℃下放置48 h,標記物的放化純度仍大于92%,降低小于5%,表明標記物在4℃環境下體外穩定性較好。從圖8可以看出,同樣在上述三種體系中,37℃下放置48 h,標記物的放化純度小于90%,降低大于5%。這說明低溫適宜此標記物的保存。

圖7 123 I-3H11在 3種介質中4℃貯存時的體外穩定性◆——人血清;□——生理鹽水;▲——pH 7.4的 PBS

圖8 123 I-3H11在 3種介質中37℃貯存時的體外穩定性◆——人血清;□——生理鹽水;▲——pH 7.4的 PBS

3.4 正常鼠體內的生物學分布

123I-3H 11在昆明小鼠體內的血液清除時間曲線示于圖9,主要臟器的放射性攝取率列于表1。由圖9可以看出,123I-3H 11血液清除較快,半清除時間為12.25±0.25 h。由表1數據可以看出,123I-3H11注入初期,血液的初始攝取較高,但清除較快;標記物主要通過肝、腎排泄;123I有親甲狀腺的性質。123I-從123I標記物脫落的結果必然導致123I-在甲狀腺富聚。實驗數據表明,甲狀腺中放射性攝取較其它組織偏高,說明123I-3H 11在體內有脫碘現象,脫落的123I-在動物體內廣泛分布。文獻[10]報道24 h后123I-大部分經尿排泄,剩下的主要定位于甲狀腺,所以游離123I-不會影響模型動物顯像。胃組織中有明顯的濃聚,這一結果與文獻[11]報道的131I-3H 11動物實驗數據一致。由于胃組織中有一定的靶細胞BGC823,全抗3H 11進入動物體內,與靶細胞結合,一旦與腫瘤細胞結合,抗體即可停留在腫瘤組織內,而其他組織內的抗體或腫瘤組織內的無關蛋白則很快排泄,這樣可降低本底,有利于模型動物顯像研究。全抗3H 11相對分子質量較大,在體內的動力學速度較慢,藥物在組織濃集的時間較長,一般大于24 h,而123I半衰期與全抗3H 11的代謝時間不相匹配。考慮可采用123I標記 3H11 Fab片段做進一步研究。

圖9 123 I-3H11在正常昆明小鼠中的血液清除曲線

表1 123 I-3H11在正常昆明小鼠體內的生物分布(,n=5)

表1 123 I-3H11在正常昆明小鼠體內的生物分布(,n=5)

血12.64±1.45 3.57±1.05 0.98±0.43甲狀腺 4.95±2.31 9.34±4.79 3.09±2.13肝7.23±2.31 2.97±1.01 0.68±0.32腎6.98±2.35 2.01±1.03 0.76±0.37肺4.96±1.43 1.25±0.67 0.57±0.21胃4.72±0.98 2.11±0.57 1.05±0.32脾4.41±1.32 2.41±0.87 0.78±0.31心3.39±1.04 1.05±0.56 0.69±0.21腸2.89±0.68 1.05±0.34 0.88±0.11骨1.51±0.98 1.13±0.64 0.72±0.21肉0.99±0.12 0.73±0.13 0.59±0.09

4 結 論

123I-3H 11的放化純度高,低溫下體外穩定性較好;正常昆明小鼠體內分布實驗表明,標記物血液清除較快,主要通過肝、腎代謝,胃組織對標記物有表達。因此,123I-3H 11是值得進一步研究的標記物,有望成為胃癌SPECT臨床顯像劑。

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