結(jié)核分枝桿菌重組Mtb81蛋白抗原血清學診斷價值的研究

陽幼榮 吳雪瓊 張俊仙 梁艷 張翠英 董梅 陳紅兵 何菊芳

(解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室 北京 100091)

結(jié)核分枝桿菌重組Mtb81蛋白抗原血清學診斷價值的研究

陽幼榮 吳雪瓊 張俊仙 梁艷 張翠英 董梅 陳紅兵 何菊芳

(解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室 北京 100091)

目的研究重組Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,評價其在結(jié)核病血清學診斷中的價值,尋找更有效的結(jié)核病診斷試劑>。方法應(yīng)用基因工程技術(shù)表達、純化rMtb81蛋白,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測192名健康者和210例肺結(jié)核患者血清中抗結(jié)核抗體>。結(jié)果rMtb81蛋白在大腸埃希菌細胞內(nèi)以包涵體形式高效表達,表達量占菌體總蛋白的30%左右,相對分子量約80.7 kD,具有良好的抗原特異性。在210例結(jié)核病患者血清中,103例菌陽患者和107例菌陰患者抗rMtb81抗體的陽性率分別為37.9%和41.1%,總的靈敏度為39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD陰性者和 97例PPD陽性者抗 Mtb81抗體的陽性率分別為 1.1%和 6.2%。結(jié)論rMtb81蛋白可能成為結(jié)核病血清學診斷的組合抗原之一。

血清學試驗;分枝桿菌,結(jié)核;重組蛋白質(zhì)類;細菌蛋白質(zhì)類;抗原,細菌

目前結(jié)核病是危脅發(fā)展中國家的重要疾病之一,隨著 HIV的蔓延,結(jié)核病疫情也越來越嚴峻。早期診斷、有效治療是結(jié)核病疫情控制的重要手段,目前血清學診斷方法已成為結(jié)核病重要的輔助診斷手段,許多重組結(jié)核分枝桿菌抗原已被用于快速血清學診斷試驗或已被評價[1-3],研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌rMtb81蛋白抗原在HIV合并感染的結(jié)核患者的血清學檢測中能與其他重組蛋白形成較強的互補性[4]。本文應(yīng)用基因工程技術(shù)表達、純化結(jié)核分枝桿菌rMtb81蛋白,并通過ELISA方法研究結(jié)核病患者血清與純化的rMtb81的抗體反應(yīng),評價rMtb81抗原在結(jié)核病免疫反應(yīng)中的作用及其在結(jié)核病血清學診斷中的價值,尋找更有效的結(jié)核病血清學診斷組合抗原。

1 材料和方法

1.1 菌種和血清來源 pET24b-Mtb81大腸埃希菌工程菌由本課題組構(gòu)建[5]。210例結(jié)核病患者血清來自全軍結(jié)核病研究所已確診為肺結(jié)核病的住院患者。192例正常人血清來自2007年入伍新戰(zhàn)士的體檢血清。

1.2 Mtb81基因的誘導(dǎo)表達 將pET24b-Mtb81大腸埃希菌工程菌接種于含硫酸卡那霉素50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至A600=0.8左右時,誘導(dǎo)表達4 h收集菌體。

1.3 SDS-PAGE SDS-PAGE電泳鑒定rMtb81的表達水平。將菌體懸浮于適量的1×SDS凝膠載樣緩沖液中,置沸水浴中5～10min,離心后取上清,加于4.5%濃縮膠和12%分離膠中進行SDS-PAGE電泳。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色和甲醇/冰醋酸脫色后,觀察結(jié)果并照相保存。

1.4 菌體破碎和包涵體提取 誘導(dǎo)后的pET24b-Mtb81大腸埃希菌工程菌按《分子克隆實驗指南》[6]介紹的方法提取包涵體,取部分上清液和包涵體沉淀進行SDS-PAGE分析,以確定Mtb81在大腸埃希菌中的表達形式。

1.5 重組蛋白的回收、純化及含量測定 采用Novagen公司生產(chǎn)的His.Bind蛋白純化試劑盒純化rMtb81蛋白,按試劑盒說明書介紹的操作步驟進行。通過Lowry法[7]測定蛋白含量,除菌過濾后置-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 應(yīng)用ELISA方法檢測血清中抗結(jié)核抗體 將結(jié)核分枝桿菌純化的rMtb81蛋白(10 μ g/ml)包被于美國Costar 96孔酶標板上,4℃過夜;用PBST洗液洗滌3次;加入1∶100倍稀釋的待檢血清,37℃溫育 1 h;用 PBST洗液洗滌 3次;加入1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG,37℃溫育1 h;再用PBST洗液洗滌3次;加入鄰苯二胺和H2O2底物顯色30 min,以2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。以空白對照調(diào)校零點,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定492 nm的OD值,取2孔平均值作為終結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所有結(jié)果均用ˉx±s表示,正常人群組與結(jié)核病人組間比較采用Kruskal-Wallis U檢驗。

2 結(jié)果

2.1 rMtb81蛋白的純化 pET24b-Mtb81重組質(zhì)粒在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后,通過SDSPAGE分析可見特異的表達產(chǎn)物帶,相對分子量約為80.7 kD左右,光密度掃描分析表明占菌體總蛋白30%左右。將誘導(dǎo)菌超聲破碎后的上清液和沉淀部分分別進行SDS-PAGE分析,沉淀部分可見較明顯的特異蛋白表達帶,而上清液中未見特異蛋白表達帶,說明表達的rMtb81蛋白大多以細胞內(nèi)不溶性包涵體的形式存在。應(yīng)用His.Bind蛋白純化試劑盒在變性條件下純化rMtb81蛋白,純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析顯示只見1條回收的蛋白帶(圖1),未見其他雜帶,經(jīng)光密度掃描分析表明其純度約為95%左右。

圖1 rM tb81蛋白的SDS-PAGE分析

圖2 肺結(jié)核組與正常人組中抗M tb81抗體OD值

表1 結(jié)核病人組與正常人組中抗Mtb81抗體檢測結(jié)果

2.2 人血清中抗結(jié)核抗體的檢測 肺結(jié)核組與正常人組中抗Mtb81抗體OD值如下圖：

肺結(jié)核組與正常人組中抗Mtb81抗體OD值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),以192例正常對照的光密度平均值+2倍標準差(0.22)為正常界限值,檢測結(jié)果如下表。

3 討論

近年來的研究[8]發(fā)現(xiàn)Mtb81蛋白是由結(jié)核分枝桿菌glcB(即Rv1837c)基因編碼的蘋果酸合酶,相對其分子量為88 kD,存在于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中,在結(jié)核合并HIV感染的患者中具有重要的血清學診斷價值。本文通過基因工程技術(shù)高效表達、純化 rMtb81蛋白抗原,其相對分子量為80.7 kD。通過ELISA方法檢測95例PPD陰性的正常人血清僅1例為陽性,陽性率為1.1%,97例PPD陽性的正常人血清中6例為陽性,陽性率為6.2%,說明結(jié)核菌潛伏感染者或卡介苗接種者血清中也存在一定的結(jié)核菌抗原刺激機體產(chǎn)生低水平的抗體。在103例涂片陽性患者血清標本和107例涂片陰性患者血清標本中,rMtb81蛋白抗原在涂片陰性患者標本中的靈敏度高于涂片陽性患者標本。這與 Chaudhary等[9]的報道一致,他們發(fā)現(xiàn)重組Mtb81在檢測涂片陽性標本時與重組38 kD的靈敏度差異無統(tǒng)計學意義,但檢測涂片陰性血清標本時的靈敏度比重組38 kD高出50%。國內(nèi)有文獻報道rMtb81的特異性和靈敏度可達96%、93%[10],可能由于患者標本選擇差異所致。

總之,不同結(jié)核病患者可能對不同的結(jié)核分枝桿菌抗原產(chǎn)生抗體。結(jié)核分枝桿菌Mtb81蛋白能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體,可與其他結(jié)核分枝桿菌抗原形成互補,提高結(jié)核病患者的陽性檢出率。我們將進一步研究rMtb81抗原與其他抗原聯(lián)合檢測抗結(jié)核抗體的臨床意義。

[1]Andersen A B,Hansen EB.Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b,a 38000-molecular-weig ht protein ofMycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun,1989,57：2481-2488.

[2]Salata RA,Sanson AJ,Malhotra IJ,Wiker HG,Harboe M,Philips NB,Danid TM.Purification and characterization of the 30,000 dalton native antigen ofMycobacterium tuberculosisand characterization of six monoclonal antibodies reactive with a major epitope of this antigen[J].J Lab Clin Med,1991,118(6)：589-598.

[3]吳雪瓊,張俊仙,夏湘萱,劉軍,李洪敏.結(jié)核分枝桿菌MPT63抗原的表達及其血清學診斷價值的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2001,11(4)：8-10.

[4]Hendrickson RC,Douglass SF,Reynolds LD,Mc Neill PD,Carter D,Reed SG,Houghton RL.Mass Spectrometric Identification of Mtb81,a Novel Serological Marker for Tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2000,38(6)：2354-2361.

[5]李香蘭,吳雪瓊,張廣宇,李娟,張靈霞,梁建.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白M tb81在大腸埃希菌中的高效表達[J].河北醫(yī)科大學學報,2005,26(1)：25-28.

[6]Sambrook J,F ritsch EF,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].第2版,北京：科學出版社.1992：19-23.

[7]陳執(zhí)中,章月華,編著.現(xiàn)代生化藥物與基因工程藥物分析[M].上海：上海醫(yī)科大學出版社.2000：421-422.

[8]Laal S,Samanich KM,Sonnenberg MG,Belisle JJ,O'Leary J,Simberkoff MS,Zolla-Pazners.Surrogate marker of preclinical tuberculosis in human immunodeficiency virus infection：antibodies to an 88-kD secreted antigen ofMycobacterium tuberculosis[J].Infect Dis,1997(176)：133-143.

[9]Chaudharya VK,Kulshreshtaa A,Gnpta G,Verma N,Kumari S,Sharma SK,Gupta A,Tyagi AK.Expression and purification of recombinant 38-kD and Mtb81 antigens ofMycobacterium tuberculosisfor application in serodiagnosis[J].Protein Expr Purif 2005,40(1)：169-176.

[10]李香蘭,張廣宇,吳雪瓊,李建行,陳素麗,謝蘭品.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白M tb81克隆、表達、純化及血清學診斷價值的初步研究[J].河北醫(yī)藥,2007,29(8)：779-782.

Serodiagnostic value of recombinant Mtb81 protein from M.tuberculosis for tuberculosis

Yang Yourong,Wu Xueqiong,Zhang Junxian,Liang Y an,Zhang Cuiying,Dong Mei,Chen Hongbing,He Jufang
Institute of Tuberculosis Research,The309th Hospital of PLA,Beijing100091,China

serologic tests;Mycobacteriu m tuberculosis;recombinant proteins;bacterial proteins;antigens,bacterial

Wu Xueqiong(wu-xueqiong@263.net)

吳雪瓊(wu-xueqiong@263.net)

北京市科技計劃研發(fā)攻關(guān)類科研基金資助項目(D08050700640802)和國家重大傳染病防治科技重大專項基金資助項目(2008ZX100 03-001)

Objective To evaluate the value of recombinant Mtb81(rMTB81)protein fromM.tuberculosison the serodiagnosis of tuberculosis(TB),and to develop more effective diagnostic reagents for TB.MethodsThe rMTB81 protein was expressed and purified by metal chelation chromatography.The antibody IgG againstM.tuberculosisrMtb81 antigen in 402 human sera were detected by ELISA.ResultsThe rMTB81 protein existed in inclusion bodies of E.coli,and amounted to 30%of total bacterial proteins.Its molecular weight was estimated about 80.7 kilodalton.Of 210 sera from TB patients,the sensitivities of antibody detection using rMTB81 protein were 37.86%in 103 bacterium-positive TB patients and 41.12%in 107 bacterium-negative TB patients.The overall sensitivity was 39.52%.Of 192 healthy subjects,their specificities of antibody detection using rMtb81 protein were 1.05%and 6.19%,respectively.The overall specificity was 3.65%.ConclusionsThe rMtb81 protein might be used as one of multiple antigens in the serodiagnosis of TB.

2009-4-21)

(本文編輯：張曉進)