慢性氟中毒對大鼠紅細胞膜流動性的影響

李大海， 申秀英，2, 章子貴

(1.浙江師范大學 生態研究所,浙江 金華 321004;2.浙江科技學院 生物工程系,浙江 杭州 310023)

慢性氟中毒是以損害牙齒和骨骼的硬組織為主的全身中毒性疾病，而非骨相損害可累及多種組織和器官.氟能夠引起紅細胞明顯變形，并能引起紅細胞膜脂質損傷和膜蛋白組分發生改變，產生毒害作用，所以紅細胞可能是氟攻擊的靶目標之一[1-3].細胞膜的流動性是細胞功能的重要參數，影響完整的膜蛋白定向、膜滲透性和跨膜轉運過程等，而細胞脂質過氧化水平的提高能夠影響細胞膜的流動性[4].張本忠[5]對30 d齡大鼠經腹腔注射染氟50 d后，用熒光偏振法發現氟能夠引起生物膜流動性下降.氟主要經過消化道進入人體，再加上人體接觸外源性化學物質往往是較低劑量的長期接觸，所以筆者在3月亞慢性染毒的基礎上，采用飲水中加氟的方式進行染毒期分別為9月和18月的慢性染毒，通過電子自旋共振(ESR)法檢測紅細胞膜的流動性，同時測定血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性，為氟中毒機制的研究提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

實驗動物由浙江省實驗動物中心提供，選用SD品系初斷乳的雄性大鼠，體質量為(65±9.8) g.隨機將大鼠分成4組，分別是對照組、低氟組、中氟組和高氟組，每組16只，其中對照組飲用自來水，其他3組飲水中分別加氟15,30,60 mg/L.每天喂食由金華市藥品檢驗所提供的實驗動物大鼠配合飼料.飼養室采用空調和自動排風裝置保持通風，室溫15～25 ℃，濕度40%～70%；以刨花為墊料，每2 d更換一次.飼養期為9,18月.

1.2 主要試劑和儀器

氟化鈉(NaF)固體(武漢華創化工有限公司)；MDA，SOD，GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)；16-DOXYL標記物(美國Sigma公司).臺式高速低溫離心機(德國Eppendor F公司);酶標儀(美國Thermo電子公司);電子自旋共振波譜儀(德國Brucker公司).

1.3 血氟的測定

大鼠飼養到第3月結束時尾部取血，采用氟離子電極法測定血氟濃度.

1.4 紅細胞膜流動性的測定

各組大鼠飼養9月后立即處死8只,18月后處死剩余的8只.大鼠斷頭取血后加入肝素鈉(50 U/mL)抗凝，離心(3 000 r/min，10 min)，除去血漿、白細胞和血小板.用預冷生理鹽水洗滌3次，收集紅細胞，加40倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，在低滲情況下溶血3 min破膜，離心(12 000 r/min，10 min)，棄去上清液，再用上述緩沖液洗滌3次，可得到乳白色的紅細胞膜.將所得紅細胞膜懸浮在2～4 mL pH 7.4等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用考馬斯亮藍法測定膜蛋白含量，使膜蛋白含量為0.5～1.0 mg/mL.取30 μL紅細胞膜懸浮液于樣品管中，加入0.2 mmol/L的16-DOXYL，在37 ℃下溫育1 h，以等滲PBS清洗3次，每次5 min，至上清液中無ESR信號檢出，除去上清液，將紅細胞膜吸入毛細石英管中室溫下檢測.檢測條件：微波功率10 mW，調制100 kHz，調制幅度2 G，掃寬100 G，時間常數0.64 s，溫度24 ℃.參照文獻[6]，所得圖譜如圖1所示,按照公式

計算旋轉相關時間.

圖1 16-DOXYL標記的紅細胞膜ESR波譜

1.5 抗氧化指標的測定

血清超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用羥胺比色法，過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性的測定采用比色法，均按相應試劑盒說明書操作.

1.6 統計方法

2 實驗結果與分析

2.1 血液內氟含量的測定

從表1可以看出，隨著給氟量的升高，血氟含量上升，且差異顯著(P<0.05)，表明氟中毒模型復制成功.

表1 血氟含量的測定結果

2.2 慢性氟中毒對紅細胞膜流動性的影響

膜流動性與旋轉相關時間成反比，旋轉時間越長，說明膜流動性越低，反之亦然.從表2可以看出，與對照組相比，2個染毒期內染氟組紅細胞膜流動性都有所下降，其中染毒期為9月時中氟組和高氟組呈顯著性下降(P<0.05)，而且中氟組下降幅度最大；而染毒期為18月時各染氟組紅細胞膜流動性顯著性降低(P<0.05)，其中高氟組下降幅度最大.與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月的各組都有一定程度的下降，其中對照組無顯著性差異(P>0.05)，而染氟組有顯著性差異(P<0.05).

表2 旋轉時間的測定結果

2.3 慢性氟中毒對血液抗氧化能力的影響

從表3可以看出:與對照組相比，染毒期為9月的中氟組MDA含量顯著上升(P<0.05)，低氟組和高氟組無統計學差異(P>0.05);而染毒期為18月的高氟組MDA含量顯著上升(P<0.05)，低氟組和中氟組無顯著性差異(P>0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月的各組MDA含量都有一定程度的上升，其中高氟組顯著性升高(P<0.05)，其他3組無統計學差異(P>0.05).

表3 MDA含量的測定結果

從表4可以看出:與對照組相比，2個染毒期中各染氟組SOD活性降低，其中染毒期為9月的中氟組呈現顯著性下降(P<0.05)，低氟組和高氟組無顯著性差異(P>0.05)；染毒期為18月時，染氟組的SOD活性顯著性下降(P<0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月各組的SOD活性都有一定程度的下降，其中高氟組顯著性下降(P<0.05)，其他3組無統計學差異(P>0.05).

表4 SOD活性的測定結果

從表5可以看出:與對照組相比，2個染毒期中各染氟組大鼠血清中GSH-Px活性呈現下降的趨勢，而且下降幅度較大，都呈顯著性下降(P<0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月各組的GSH-Px活性都有所下降，其中高氟組顯著性下降(P<0.05)，其他3組無統計學差異(P>0.05).

表5 GSH-Px活力的測定結果

3 討 論

氟是一種原生質毒物，生物膜是氟毒性作用的靶子之一，以多種生物膜為材料的生化毒理學研究發現，氟與生物膜之間的相互作用可以改變膜結合蛋白的活性和膜脂[7-9].曹言濤等[10]發現，氟能夠抑制牛脾淋巴細胞膜ATP酶活性，從而影響細胞膜的功能.章子貴等[11]發現，長期攝入高氟導致紅細胞膜磷脂含量降低，飽和脂肪酸比例升高，不飽和脂肪酸比例降低，而且多不飽和酸變化比較明顯，表明膜流動性可能發生變化，出現老化現象.本實驗發現，染氟組大鼠紅細胞膜流動性下降，9月染氟期中氟組和高氟組明顯降低，而18月時所有染氟組都明顯地降低.本實驗結果提示：慢性氟中毒使紅細胞膜生物理化性質發生明顯的變化，導致紅細胞形態改變和功能下降，這對地方性氟中毒病的發生、發展可能起一定的作用.

從本實驗結果還可發現，與9月染氟期相比，18月染氟期的紅細胞膜流動性和抗氧化能力在同組中都呈現不同程度的下降，說明隨著染氟期的加長，氟對機體的損傷作用逐漸積累并加強.值得注意的是，在染氟期為9月時中氟組對紅細胞膜流動性及抗氧化能力的有害影響高于高氟組，而染氟期為18月時高氟組的紅細胞膜流動性和抗氧化能力損傷最嚴重，這可能與過高劑量的氟在引起機體損傷的同時也能引起機體代償性的保護有關，而隨著染毒期的延長，這種機體代償性保護性作用消失了.

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