密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥模型角膜和淚腺組織的保護作用

李懷鳳 彭清華 姚小磊 王 方 陳佳文 吳權龍 李傳課 李 點 朱惠安

近年來研究表明基于免疫的炎癥反應是各種類型干眼癥發病的共同機制，淚腺及眼表的炎癥可導致淚腺及眼表上皮細胞損傷及凋亡、淚液中水樣液及粘液的分泌減少。研究去勢雄鼠干眼癥眼表面炎癥反應與干眼癥病因之間的關系是研究干眼癥發病機制的關鍵。本研究通過制作去勢雄鼠干眼癥模型，觀察干眼癥各組角膜和淚腺光鏡及淚腺電鏡超微組織結構的變化，為其發病機制和治療方法提供事實依據；并通過密蒙花總黃酮對其進行干預，探討其防治干眼癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康1月齡雄性Wistar大鼠150只（中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供），體重100g左右，常規喂養。 隨機分為 A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2、A3、B3、C3、D3、E3共 15 組，每組 10 只。 分別為：A：正常組；B：假手術對照組；C：手術對照（去勢）組；D：雄激素治療組對照；E：密蒙花總黃酮治療組；1代表飼養1個月后；2為飼養3個月后；3為飼養5個月后。

1.2 實驗動物模型制作參照有關文獻〔1〕

將實驗鼠切除雙側睪丸及附睪；假手術組只切開陰囊而不切除睪丸，正常組不做任何處理。

1.3 主要藥品和試劑

密蒙花（產于湖南邵陽）：密蒙花干藥材由湖南九匯現代中藥有限公司提供，其總黃酮制備由該課題組博士在湖南省植物提取工程提取中心完成 （密蒙花藥材中蒙花苷含量為0.85%,提取成品中蒙花苷含量約17%，蒙花苷中總黃酮含量>80%）；丙酸睪酮注射液（25mg/ml，市售）：天津金耀氨基酸有限公司生產；Leica石蠟切片機：德國Leica公司生產；Hitachi h-600型透射電子顯微鏡：日本日立公司生產。

1.4 給藥方法

各組在造模后1周，待傷口基本愈合后開始用藥。雄激素治療組丙酸睪酮注射液以1∶4麻油稀釋后按0.5ml/kg大腿肌肉注射，1次/3d；密蒙花總黃酮治療組以1%密蒙花提取物生理鹽水混懸液5ml/kg灌胃，1次/天；其余3組以0.9%生理鹽水5ml/kg灌胃，1 次/天。

1.5 干眼癥大鼠模型的檢查方法

檢查均由同一人完成，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同。 參照有關文獻〔2，3〕，各組動物分別于 1、3、5 個月后，行淚膜破裂時間（BUT）、角膜熒光素染色檢查及Schirmer I試驗。BUT：用玻璃棒蘸2%熒光素鈉在下瞼結膜囊內涂抹，使眼瞼閉合熒光素均勻分布于角膜表面后，固定其上下瞼使角膜充分暴露，于裂隙燈下用鈷藍光照射觀察，從最后一次瞬目開始計時，記錄淚膜上出現第一個破裂點的時間。角膜熒光素染色：玻璃棒蘸熒光素涂抹于下瞼結膜囊，裂隙燈下觀察，將角膜分為4個象限〔4〕，0 級:無染色（－），1 級:散在點狀染色（＋），2 級:密集型點狀染色（++），3 級:片狀染色（+++）。Schirmer I試驗〔5〕：用 2.5mm×35mm 淚液檢測濾紙條，將一端折彎5mm，置于下瞼內側1/3結膜囊內，其余部分懸垂于皮膚表面。閉眼5分鐘后測量濾紙濕潤長度（不包括反折）。

1.6 標本采集

1、3、5 個月后各組隨機抽取10只大鼠，20%烏拉坦全身麻醉后斷頭法處死各組動物，即刻摘取雙眼淚腺、角膜組織，4%多聚甲醛固定準備，HE染色，光鏡觀察各組織結構。

1.7 統計學處理

所有數據均經SPSS15.0系統軟件處理。計量資料以平均數±標準差（±s）表示。若滿足正態性和方差齊性，則用多因素方差分析兩兩比較法；不滿足正態性和方差齊性時，則用非參多重比較法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干眼癥的傳統檢查結果

2.1.1 角膜熒光素染色：A、B組角膜熒光素染色無明顯改變；C組大鼠喂養3個月后，角膜上皮開始進行性缺損，熒光素染色呈陽性，且隨時間加重；D、E組于去勢治療3、5個月后見角膜熒光素染色，染色點較C組減少（表1）。

表1 各組鼠角膜熒光素染色的比較

2.1.2 Shirmer實驗：同一組別不同時間段的比較：A組、B組、D組各時間段比較差異無統計學意義（P＞0.05）；C組3、5個月與1個月比較差異有統計學意義（P＜0.01）；C組 3、5個月時比較差異無統計學意義（P＞0.05）；E組3個月與1個月比較差異無統計學意義（P＞0.05）；E組5個月與1個月比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

同一時期不同組別的比較：1個月后，A、B、C、D、E 組間差異無統計學意義（P＞0.05）；3 個月后，A、B、C、D、E 組間差異有統計學意義（P＜0.05）；B、D 組與 A 組差異無統計學意義（P＞0.05）；A、D、E 與 C 組差異有統計學意義（P＜0.05）；D與E組差異無統計學意義（P＞0.05）；5 個月后，B、D 組與 A 組差異無統計學意義（P＞0.05）；D、E組與C組差異有統計學意義（P＜0.01）；D 組與 E 組差異有統計學意義（P＜0.05,表 2）。

表2 各組鼠Shirmer實驗試紙長度測定的比較（±s，mm）

表2 各組鼠Shirmer實驗試紙長度測定的比較（±s，mm）

注：采用非參多重比較法（Games-Howell）組間 F=7.982，組內F=10.949。①A組與B組比較P=0.997,②2組與3組比較P=0.47。

分組 N 1（1個月） 2（3個月） 3（5個月）A B C D E 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 6.4±1.0 6①6.3±1.1 2①7.2±1.3 0 6.0±1.1 7 5.8±1.0 2 6.3±1.1 2①②6.2±1.5 1①②4.0±0.8 4②6.1±0.5 3②5.4±0.4 4②6.2±1.1 0①②6.1±1.2 4①②3.6±0.6 1②5.8±0.3 8②4.8±0.4 7②

2.1.3 淚膜破裂時間（BUT）：同一組別不同時間段的比較：A、B組各時間段差異無統計學意義（P＞0.05）；C組1個月、3個月、5個月相比差異均有統計學意義（P＜0.01）；D組 1、3個月比較差異無統計學意義（P＞0.05），5 個月與 1、3 個月比較差異有統計學意義（P＜0.05）；E組 1、3及 5個月比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

同一時期不同組別的比較：A、B組在各時間段差異均無統計學意義（P＞0.05）；1 個月后，A、B、C、D、E 組間差異無統計學意義（P＞0.05）；C2、E2與 A2組差異有統計學意義（P<0.05）；3個月后，D、E 組與C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；D與E組間差異無統計學意義（P＞0.05）；5 個月后，C、D、E 與 A組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；D、E與C組差異有統計學意義（P＜0.01）；D與E組差異無統計學意義（P＞0.05,表 3）。

表3 各組鼠淚膜破裂時間（BUT）測定的比較（±s，秒）

表3 各組鼠淚膜破裂時間（BUT）測定的比較（±s，秒）

注：采用多因素方差分析的兩兩比較（LDS法）組間F=15.295，組內F=19.895。*A組與B組比較P=1。

分組 N 1（1個月） 2（3個月） 3（5個月）A B C D E 10 10 10 10 10 12.0±2.22*11.5±2.33*11.0±2.59 11.4±2.32 11.8±1.13 12.0±2.69*12.0±2.72*8.0±1.50 11.0±1.45 10.0±2.01 11.0±1.91*11.5±2.04*5.0±1.06 9.0±1.35 8.0±1.11

2.2 角膜及淚腺的光鏡觀察

2.2.1 正常對照組（A組）:角膜:上皮層、前彈力膜、基質層、后彈力膜和內皮層清晰可見，上皮層光滑完整。基質層內見少量角膜細胞（圖1）。淚腺:表面有薄層結締組織被隔，結締組織深入實質將腺組織分成大小不等的小葉。小葉及腺泡間可見散在的淋巴細胞、巨噬細胞及漿細胞。腺泡大小均勻，排列緊密（圖 2）。

2.2.2 假手術對照組（B組）:角膜和淚腺：光鏡下所見基本同正常組。

2.2.3 手術模型組（C組）:角膜:與正常組相比，C1組：上皮層細胞層次增加，局部扁平細胞見不規則少量脫失（圖3）；C2組：上皮層細胞層次增加，扁平細胞見不規則片狀脫失（圖4）；C3組：上皮層細胞層次增加，表層扁平細胞不規則缺失，翼狀細胞外露；基質層水腫增厚，其內細胞成分增多，見大量炎性細胞浸潤（圖5）。淚腺:與正常組淚腺相比，C1組：腺泡內分泌泡有所增多（圖6）；C2組：腺泡內及腺泡細胞內分泌物增多，見細胞核分裂相（圖7）；C3組：淚腺腺泡密集，排列規則，腺泡細胞內仍見大量分泌顆粒，腺泡間結締組織內見細胞成分增多，見分葉核及單核細胞浸潤（圖8）。

2.2.4 雄激素治療對照組（D組）：角膜:與正常組相比，D1組：結構基本同正常組淚腺；D2組：上皮層細胞層次增加，局部扁平細胞見不規則少量脫失；D3組：上皮層細胞層次增加，扁平細胞見不規則片狀脫失。淚腺:與正常組淚腺相比，D1組：基本同正常組淚腺；D2組：腺泡內分泌泡有所增多；D3組：腺泡內及腺泡細胞內分泌物增多，見細胞核分裂相。

2.2.5 密蒙花總黃酮治療組（E組）

角膜和淚腺光鏡與D組基本相同（圖9、10）。

2.3 淚腺的透射電鏡觀察

正常對照組（A組）透射電鏡觀察：可見淚腺細胞內結構清楚，核膜完整，核仁明顯，腺上皮細胞間有緊密連接，細胞內粗面內質網豐富、分泌面有大量分泌泡，細胞表面有微絨毛結構（圖11）。

假手術對照組（B組）透射電鏡觀察：所見基本同正常組淚腺。

手術模型組（C組）透射電鏡觀察：C1組：所見結構基本同正常組淚腺（圖12）；C2組：核膜皺縮，有局灶變性壞死 （溶酶體呈黑洞狀），線粒體腫脹 （圖13）；C3組：腺泡排列規則，每個腺泡中央見腺泡腔，腺泡細胞內上部可見大量分泌顆粒，腺泡細胞基底部見大量粗面內質網、高而基體；線粒體空泡化；腺泡細胞之間可見緊密連接；腺泡間結締組織內見少量小靜脈、毛細血管及巨噬細胞、漿細胞浸潤，核膜皺縮，有局灶變性壞死（溶酶體呈黑洞狀），線粒體腫脹，細胞間隙增寬，細胞邊壞死狀，局灶凋亡壞死，凋亡明顯（核固縮，染色質邊集）（圖14）。

雄激素治療對照組 （D組）透射電鏡觀察：D1組：空泡改變（或有類脂滴樣空泡改變），細胞間隙增寬；D2組：管腔微絨毛有脫落，線粒體嵴丟失，有空泡樣變，管腔有局灶性病變，線粒體腫脹，有脂滴樣變，核固縮，凋亡相對明顯，血管及內皮變化不大；D3組：線粒體輕腫脹，核輕腫脹，局灶水腫變性，疑核壞死，有包涵體結構。

密蒙花總黃酮治療組（E組）透射電鏡觀察：E1組：線粒體腫脹，空泡變明顯。E2組：內質網相對豐富，染色質邊集。E3組：線粒體腫脹減輕，丟失或成空泡變（圖 15）。

3 討論

近年來多項研究結果均顯示：隨著年齡的增加，干眼的發病率呈明顯的上升趨勢，其中女性更明顯〔6〕。干眼的動物模型也已經幫助我們證實了雄激素在促進淚液分泌功能方面的作用。雄激素水平的降低可通過其上的受體降低而加重干眼癥患者角膜和淚腺的損害，從而加重干眼的眼表損害。

本研究以此為依據制作了去勢雄鼠干眼癥動物模型，手術切除雄鼠雙側睪丸，結果3個月后發現去勢雄組鼠角膜熒光素染色呈點狀。運用傳統的檢查方法對去勢雄鼠的眼表情況進行檢查發現，去勢組雄鼠5個月后Schirmer I實驗、淚膜破裂時間（BUT）明顯小于正常對照組，且隨觀察時間延長差異有統計學意義。說明雄激素水平下降后可導致模型動物淚液分泌減少、淚膜穩定性下降、角膜表面染色，可診斷為干眼癥。

本實驗自大鼠造模1周后開始用藥，在傳統檢查方面，密蒙花總黃酮治療組3、5個月后，角膜熒光素染色明顯比去勢組減輕，與雄激素治療的對照組無明顯差別；SIT檢查在3個月后,密蒙花總黃酮治療組淚液浸濕濾紙長度明顯長于去勢組 （P＜0.01），與雄激素治療組療效差異無統計學意義（P＞0.05）；5個月后，密蒙花總黃酮治療組明顯優于去勢組，差異有統計學意義（P＜0.05），與雄激素治療組相比療效稍差（P＜0.05）；BUT 檢查在用藥 3、5 個月后，密蒙花總黃酮治療組淚膜破裂時間長于去勢組，與雄激素治療組無明顯差別。

密蒙花為馬錢科落葉灌木密蒙花樹的花蕾，其味甘，性微寒，歸肝經。有清熱（瀉火）養肝，明目退翳之功效。主治目赤翳障，目昏干澀等癥。密蒙花提取物因其有高含量的黃酮類物質，一方面它能夠與雌激素受體（ER）結合產生擬雌激素活性作用；另一方面還能間接或可能直接產生擬雄激素活性作用〔9〕。近期研究表明：密蒙花黃酮類提取物對干眼癥有良好的治療效果，其機制主要與密蒙花黃酮能夠有效調節淚腺局部炎癥反應和細胞凋亡有關，能改善淚腺超微結構，從而維持淚液基礎分泌量〔10，11〕。

本實驗，光鏡觀察下見密蒙花總黃酮治療組可以減輕去勢導致的角膜和淚腺炎癥浸潤和細胞壞死脫落，與雄激素治療組無差別。電鏡觀察淚腺超微結構見淚腺細胞線粒體和內質網改變輕微，顯示其對去勢所致干眼癥淚腺和角膜有一定的保護作用。密蒙花總黃酮在治療去勢雄鼠干眼癥動物模型上有顯著療效，減輕了去勢雄鼠逐漸加重的淚腺分泌功能損害，延緩了去勢雄鼠淚腺超微結構等病理學改變。

總之，在去勢雄鼠干眼癥發病過程中，淚腺分泌功能損害，淚液量和質的改變導致淚膜穩定性下降、角膜上皮缺損，產生炎癥反應，導致干眼癥的發生和發展。密蒙花總黃酮在治療去勢雄鼠干眼癥動物模型上有較好療效，而且減輕了去勢雄鼠逐漸加重的淚腺分泌功能和角膜上皮的損害，這可能是其治療干眼癥的關鍵機制之一。

圖1 正常對照組角膜HE染色×400。圖2正常對照組淚腺HE染色×400。圖3去勢組雄鼠1個月角膜HE染色×400。圖4去勢組雄鼠3個月角膜HE染色×400。圖5去勢組雄鼠5個月角膜HE染色×400。圖6去勢組雄鼠1個月淚腺HE染色×400。圖7去勢組雄鼠3個月淚腺HE染色×400。圖8去勢組雄鼠5個月淚腺HE染色×400。圖9密蒙花總黃酮治療組5個月角膜HE染色×400。圖10密蒙花總黃酮治療組5個月淚腺HE染色×400。圖11正常對照組淚腺透射電鏡×8K。圖12去勢組雄鼠1個月淚腺透射電鏡×12K。圖13去勢組雄鼠3個月淚腺透射電鏡×8K。圖14去勢組雄鼠5個月淚腺透射電鏡×8K。圖15密蒙花總黃酮治療組5個月淚腺透射電鏡×8K。

1 馬軼群.去勢雄兔干眼癥模型角膜上皮細胞凋亡及相關基因表達的研究[J].眼科研究，2004，22（3）:286-289.

2 林 靜.去勢雌干眼癥動物模型制作及發病機制的研究[C].青島：青島大學，2005.

3 張 梅，陳家祺，劉祖國.干眼癥檢查的進展[J].眼科研究，2001，19（2）:184-187.

4 Macri A，Rolando M，pflugfelder S.A standardized visual scale for evluation of tear fluoresecein clearance[J].Ophthalmology，2000，107（7）:1338-1343.

5 田明霞，王傳富.暴露性干眼癥大鼠模型角膜上皮細胞凋亡相關基因的表達[J].眼科新進展，2006，26（10）:747-750.

6 Moss SE，Klein R，Klein BE.Incidence of dry eye in an older population[J].Arch Ophalmoa，2004，122（3）：6 369-373.

7 Xiu Jun Song， De-Quan Li， William Farley， et a1.Neurturin-Deficient MiceDevelop Dry Eye and Keratoconjunctivitis Sicca[J].InvestigativeOphthalmologyandVisualScience，2003，44（10）：4223-4229.8 AzumaM，Motegi K，Aota K，et al.Role of cytokines in the destruction of acinar structure in Sj?grn′s syndrome salivary glands[J].Lab Invest，1997，77（3）：269-280.

9 姚小磊，彭清華，吳權龍，等.密蒙花提取物對去勢導致干眼癥白兔淚腺細胞凋亡的影響[J].中國中醫眼科雜志，2007，17（3）：139-144.

10 姚小磊，彭清華，吳權龍.密蒙花提取物治療兔去勢所致干眼癥[J].眼視光學雜志，2008，10（1）：21-26.

11 彭清華，姚小磊，吳權龍，等.密蒙花提取物對去勢雄兔干眼癥的預防作用[J].中華眼科雜志，2008，44（11）：1011-1019.