不同中醫內治法對實驗性家兔視網膜血管病變的干預研究

張志芳 李慶生

視網膜血管炎（retinal vasculitis，RV）是一大類累及視網膜血管的眼內炎癥性疾病〔1〕，僅侵犯動脈或靜脈較少見，多數是兩者均受累。它主要發生于年輕人，且視力受損比較嚴重〔2〕。目前對視網膜血管炎的治療主要是應用糖皮質激素和各種新型免疫抑制劑，但對于這些療法的使用仍存在較大爭議。

根據我們前期實驗〔3〕，用慶大霉素 500μg 對家兔進行玻璃體腔注射后視網膜結構損傷相對較輕，視網膜及血管能產生持續平穩的炎性反應，其臨床特點及病理改變與視網膜血管炎有很多相似之處，不失為一個良好的造模方法。前期實驗中使用《千金要方》犀角地黃湯、地塞米松和生理鹽水對慶大霉素致家兔視網膜損傷模型進行療效觀察〔4〕，結果表明，犀角地黃湯中劑量對慶大霉素致視網膜及血管的損傷有明顯的治療作用。

我們在中醫眼科理論指導下，選用方劑犀角地黃湯、桃紅四物湯、黃連解毒湯及知柏地黃湯對慶大霉素致青紫藍兔視網膜損傷模型進行觀察，從臨床表現、病理組織及超微結構等方面進行比較，對中藥治療視網膜藥源性損傷及繼發的炎癥反應進行療效評價和作用機理的探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：青紫藍兔64只，雌雄各半，體重2~2.5kg，普通級環境下分籠飼養，22~25℃，循環光照（14h/10h，光照/黑暗）。購自北京生物制品有限公司。

1.1.2 主要藥物和試劑：中藥均購自北京燕北飲片廠（批號041016）經中藥劑師鑒定并水煎制成濃縮液：大劑量組相當于臨床劑量4倍；中劑量組相當于臨床劑量2倍，參考《藥理實驗方法學》與人折算。具體方藥如下：犀角地黃湯《千金要方》：水牛角30g、生地24g、赤芍12g、丹皮9g。桃紅四物湯《醫宗金鑒》：桃仁 9g、紅花 6g、當歸 9g、川芎 6g、赤芍 9g、生地12g。黃連解毒湯《外臺秘要》：黃連9g、黃芩6g、黃柏6g、梔子9g。知柏地黃湯 《醫宗金鑒》：熟地24g、山藥 12g、丹皮 9g、茯苓 9g、澤瀉 9g、黃柏 9g、知母9g、山萸肉12g。其它藥物及試劑：慶大霉素（天津金耀氨基酸有限公司，批號0406092），水合氯醛（北京市旭東化工廠，批號040512），熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號H44023401）ICAM-1抗體（Santa Cruz公司），von Willebrand因子抗體（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：64只健康青紫藍兔適應性喂養3天后，隨機分為8組，每組8只，分別為空白對照組（I組）、陽性對照組犀角地黃湯中劑量組（II組）及實驗組桃紅四物湯大劑量組（III組）、中劑量組（IV組）；黃連解毒湯大劑量組（V組）、中劑量組（VI組）；知柏地黃湯大劑量組（VII組）、中劑量組（VIII組）。

1.2.2 造模方法：將青紫藍兔用10%水合氯醛腹腔注射全身麻醉后，眼局部滴用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，先用1ml注射器針頭在下方角膜緣平行穿刺放出0.1ml房水，而后用裝有29號TB針頭的1ml注射器自上方角膜緣后3~5mm刺入玻璃體，直接檢眼鏡觀察下使針尖達玻璃體中央，并使針尖背向視網膜，緩慢注入慶大霉素500μg（藥物使用生理鹽水稀釋，盡量避免稀釋偏差，容量均為0.1ml），而后緩慢拔針，用棉簽輕按針孔數秒后觀察晶體無劃傷、玻璃體內無出血者繼續進行實驗觀察。

1.2.3 給藥方法：造模24h后開始給藥，空白對照組用生理鹽水給家兔灌胃，2次/天，5ml/次；中藥各組分別用不同濃度中藥灌胃，2次/天，5ml/次。

1.2.4 眼科檢查：從給藥第1天起用裂隙燈及檢眼鏡密切觀察各兔眼部體征。于造模后第7天、14天用眼底熒光血管造影儀進行各組兔的眼底彩照和熒光素眼底血管造影（將家兔全麻及局麻后，用美多麗滴眼液充分散瞳，由助手將兔頭部固定于儀器下頜托上，通過調整兔頭部和儀器的相對位置采集眼底信息）。觀察各組兔眼前、后節的病理變化，記錄各個陽性體征，參照張惠蓉等報道的方法〔5〕，將眼底彩照組合后用計算機圖象分析處理系統測算視網膜出血面積和視盤面積比值。

1.2.5 病理檢查：分別于給藥后第7天、14天全麻后摘除每組4只家兔雙眼，每組隨機取6只眼球完整置于10%甲醛溶液中固定，余2只眼球快速從角膜緣切開，輕取出晶狀體及玻璃體后立即置于4℃2.5%戊二醛溶液中固定，行電鏡觀察。HE染色下行炎性細胞記數：定位每一張眼球壁全層切片連續3個切面中視網膜血管區，用細胞分類記數器于20倍光鏡下記數每個切面中全部血管及周圍一個直徑區域的炎性細胞數量及分類，計算其平均值。免疫組織化學結果分析：每一張組織切片分別選取3個連續視野對血管區視網膜進行圖象采集，用計算機圖象分析處理軟件測算灰度值。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0軟件系統進行統計學處理，計量資料采用t檢驗。

2 結果

2.1 視網膜出血面積和視盤面積比值（表1）

表1 視網膜出血面積和視盤面積比值統計表（N=6）（±SD）

表1 視網膜出血面積和視盤面積比值統計表（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05。

組 別 7天 1 4天空白對照組 Ⅰ 3.1 9 0±1.2 2 6 1.7 2 7±0.5 1 8陽性對照組 Ⅱ 1.2 8 0±0.2 5 0①② 1.1 7 2±0.5 2 7②實驗組 Ⅲ 2.0 9 4±0.6 9 8① 0.6 6 8±0.5 3 4①②Ⅳ 1.9 7 1± 0.6 8 8① 0.3 4 8± 0.4 7 7①Ⅴ 1.9 7 4± 0.5 8 5① 0.9 2 8± 0.4 7 8①②Ⅵ 0.5 4 6± 0.3 5 6① 0.8 3 9± 0.4 7 2①②Ⅶ 1.4 2 6± 0.2 7 8①② 1.2 2 7± 0.4 2 7②Ⅷ 1.4 0 5± 0.2 5 9①② 1.0 9 3± 0.4 5 1②

空白對照組第14天出血比第7天減少，出血逐漸吸收，表明第7天是視網膜出血高峰。各中藥治療組都有明顯抑制視網膜出血的作用。第7天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比：t值依次為5.365,5.120,5.138,5.134,5.402,5.321,5.389,P＜0.01。黃連解毒湯中劑量組（VI組）與其它中藥治療組相比出血量最少：Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ組t值依次為1.568、1.894、1.649,P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組 t值依次為 2.985、2.502、2.451，P＜0.01。 第 14 天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比：Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ組t值依次為1.756、1.542、1.875，P＜0.05； Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI組 t值依次為2.708、2.886、 2.598、2.643，P＜0.01。 桃紅四物湯中劑量組 （IV組）與其它中藥治療組相比出血量最少：t值依次為 1.785、1.498、1.685、1.603、1.804,1.756，P＜0.05。

2.2 視網膜血管及周圍炎性細胞記數及分類（表2）

表2 視網膜血管及周圍炎性細胞數量統計表（N=6）（±SD）

表2 視網膜血管及周圍炎性細胞數量統計表（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05；③P＞0.05。

組 別 7天 14天空白對照組 Ⅰ 0.811±0.160 0.741±0.050陽性對照組 Ⅱ 0.555±0.110② 0.525±0.129②實驗組 Ⅲ 0.382±0.210① 0.351±0.176①②Ⅳ 0.352± 0.189① 0.293± 0.125①Ⅴ 0.496± 0.344① 0.467± 0.100①Ⅵ 0.410± 0.216① 0.397± 0.051①Ⅶ 0.760± 0.116③ 0.631± 0.209③Ⅷ 0.713± 0.145③ 0.581± 0.195③

除知柏地黃湯大劑量組、中劑量組外，其它各中藥治療組均有明顯減少視網膜炎性細胞數量的作用。第7天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比:Ⅱ組 t值為 2.243，P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI組 t值依次為 2.780、2.868、2.645、2.675，P＜0.01；Ⅶ、Ⅷ組 t值依次為 1.309、1.324，P＞0.05。 第 14 天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比:Ⅱ組t值為2.438，P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI組 t值依次為 3.143、3.256、2.898、3.098，P＜0.01； Ⅶ、 Ⅷ組 t值依次為 1.012、1.240，P＞0.05。與犀角地黃湯組（II組）相比:Ⅲ組 t值為 2.904，P＜0.05;Ⅳ組 t值為 3.253，P＜0.01。

2.3 免疫組織化學結果分析

2.3.1 視網膜ICAM-1表達結果（表3）：第7天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比：Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、VI、 Ⅶ、 Ⅷ組 t值依次為 3.381、3.430、3.134、3.389、3.289、3.296，P＜0.01；Ⅲ組 t值為 1.410,P＞0.05。 桃紅四物湯中劑量組（IV組）比大劑量組（III組）ICAM-1的表達明顯降低:t值為3.426,P＜0.01。黃連解毒湯中劑量組（VI組）比黃連解毒湯大劑量組（V組）ICAM-1的表達明顯降低:t值為2.278,P＜0.05。第14天時與空白對照組相比:Ⅳ組t值為3.351,P＜0.01；VI組t值為2.787,P＜0.05。與犀角地黃湯中劑量組（II組）相比:Ⅲ、Ⅴ組 t值依次為 2.386、2.466,P＜0.05；Ⅳ、VI組 t值依次為 3.318、3.105，P＜0.01。桃紅四物湯中劑量組（IV組）比大劑量組（III組）I CAM-1 的表達明顯降低:t值為 3，465，P＜0.01。

表3 視網膜血管區 ICAM-1的 OD 值（N=6）（±SD）

表3 視網膜血管區 ICAM-1的 OD 值（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05；③P＞0.05。

組 別 7天 14天空白對照組 Ⅰ 0.242±0.001 0.236±0.001陽性對照組 Ⅱ 0.238±0.001① 0.237±0.001實驗組 Ⅲ 0.241±0.003③ 0.236±0.002②Ⅳ 0.237± 0.001① 0.233± 0.001①Ⅴ 0.240± 0.002① 0.235± 0.001②Ⅵ 0.238± 0.001①② 0.234± 0.003②Ⅶ 0.239± 0.002① 0.237± 0.001Ⅷ 0.238± 0.002① 0.236± 0.002

2.3.2 視網膜von Willebrand因子表達結果（表4）：第7天時陽性對照組、實驗組與空白對照組相比:t值依次為1.435,1.763,1.743,1.598,1.746,1.759,1.756,P>0.05。與犀角地黃湯中劑量組（II組）相比:Ⅲ、Ⅶ組t值依次為2.246，2.223，P<0.05。 第 14天時與犀角地黃湯中劑量組（II組）相比:Ⅴ、Ⅶ組t值依次為2.098,1.989,P<0.05。

表4 視網膜血管區von Willebrand因子的OD值（N=6）（±SD）

表4 視網膜血管區von Willebrand因子的OD值（N=6）（±SD）

注：①P＜0.05；②P＞0.05。

組 別 7天 14天空白對照組 Ⅰ 0.244±0.002 0.237±0.001陽性對照組 Ⅱ 0.266±0.066② 0.241±0.003實驗組 Ⅲ 0.237±0.002①② 0.240±0.006Ⅳ 0.240± 0.002② 0.239± 0.001Ⅴ 0.243± 0.004② 0.237± 0.001①Ⅵ 0.240± 0.002② 0.237± 0.001Ⅶ 0.238± 0.002①② 0.237± 0.001①Ⅷ 0.238± 0.003② 0.241± 0.001

2.4 視網膜血管消化鋪片

空白對照組視網膜大量出血，血管迂曲擴張，呈節段狀阻塞，血管及其周圍可見大量炎性細胞浸潤，大部分出現內皮細胞和周細胞的凋亡小體，管壁細胞稀疏，可見新生血管生成；各中藥治療組視網膜可見不同程度的出血，血管迂曲，較空白對照組為輕，大量紅細胞填塞血管腔，炎性細胞局部浸潤，偶見內皮細胞和周細胞的凋亡小體，可見新生血管生成；第14天與第7天相比，各組視網膜血管消化鋪片表現均有不同程度的減輕。

2.5 電鏡觀察

空白對照組第7天視網膜血管栓塞，內皮細胞線粒體嵴斷裂，核仁邊聚，RPE細胞結構破壞嚴重，胞漿大量線粒體空泡變，類脂體增多，細胞核空泡變，神經節細胞、內顆粒層細胞、外顆粒層外側線粒體均變性。第14天視神經髓鞘變性，局部液化、膨出，鞘軸間隙增寬，神經節細胞線粒體腫脹、核溶解。其它各中藥治療組第7天RPE細胞核空化，頂端微絨毛減少，線粒體空泡變，有個別巨噬細胞突破RPE膜。視網膜血管內皮細胞、周細胞線粒體腫脹，類脂體增多，神經纖維局灶性壞死，空泡形成，神經節細胞胞質空化、水腫。RPE細胞核內可見初、次級溶酶體。第14天RPE細胞核空泡變，感光細胞外節脫落，RPE、內皮細胞、血管平滑肌細胞及神經節細胞線粒體均腫脹。

3 討論

視網膜血管炎似屬祖國醫學 “云霧移睛”、“暴盲”、“血衄”等范疇，多從“血證”討論〔6〕。 歷代醫家認為，出血的原因主要有：氣不攝血、血熱妄行及瘀血內停。臨床所見視網膜血管炎所致的視網膜和玻璃體出血，多數不能及時吸收，瘀積于眼底是為瘀血，瘀久化熱成為瘀熱。故瘀與熱兩者互為因果，以致于長期反復出血。目前在治療本病時，出血初發或復發，比較新鮮時，病屬熱重于瘀，則涼血止血，佐以祛瘀；眼底出血較陳舊，或玻璃體出血久不吸收，病屬瘀重于熱，則活血化瘀，佐以涼血止血；出血基本吸收，視網膜血管炎癥比較穩定，病屬瘀熱傷陰，則滋陰涼血，佐以散瘀之品。

本研究結果表明，桃紅四物湯中劑量能明顯改善慶大霉素致家兔視網膜出血及炎癥反應，減少視網膜血管及其周圍炎性細胞數量，明顯降低視網膜血管區ICAM-1的表達，其對視網膜von Willebrand因子表達的下調作用并不明顯，推測它可能是通過降低視網膜ICAM-1的表達從而減少炎性細胞黏附而減輕炎癥反應。桃紅四物湯出自清代吳謙所著的《醫宗金鑒》，方由四物湯加桃仁、紅花組成，具養血活血之功效，主治婦女月經先期屬血瘀者。根據現代藥理研究，桃紅四物湯治療很多眼科疾病均有良好的療效〔7〕。其眼科藥理如下：當歸能顯著提高人體免疫功能，促進吞噬作用，有很強的干擾素誘生作用，有抗炎鎮痛及抗損傷作用；白芍有明顯鎮痛、解痙、抗炎、抗潰瘍作用，能促進巨噬細胞的吞噬功能，有較強的廣譜抗菌作用；川芎所含川芎嗪能增強單核巨噬細胞的吞噬功能，提高淋巴細胞轉化率，促進抗體的形成，可以抑制血小板形成，可使已聚集的血小板迅速解聚，達到化瘀效果；熟地、生地均有止血和抑制血栓形成的作用，故既可生血、養血，又可化瘀通經；紅花可抑制血小板凝聚和增強纖維蛋白溶解，有抑菌抗炎和解痙作用；桃仁有抗炎、抗過敏作用。綜觀全方，其活血散瘀力較強，有推陳出新之功。由此推斷，桃紅四物湯可通過多種作用機制抗凝活血，減輕組織血管的炎癥反應，改善循環，因而對于臨床視網膜血管炎癥性疾病有著廣泛有效的應用前景。

黃連解毒湯是唐代醫家王燾引錄前人崔氏的名方,載于其所編著的《外臺秘要》中,是清熱解毒的代表方,具清熱、瀉火、解毒之功效,主治實熱火毒、三焦熱盛證。實驗結果顯示,其中劑量在早期能明顯減少視網膜出血，我們分析這與慶大霉素致家兔視網膜損傷為急性毒性反應，主要表現為血管栓塞出血，而中藥藥理學的現代研究表明,將其提取物灌胃,對家兔體內血栓形成有顯著的抑制作用,并能抑制ADP誘導的兔血小板聚集〔8〕；在體外，黃連解毒湯能抑制腎上腺素、膠原、血清血栓形成促進因子Ⅱ、花生四烯酸誘導的血小板聚集，同時還能抑制腎上腺素、ADP、膠原等誘導的血小板釋放功能〔9〕有很大關系。知柏地黃湯同樣出自《醫宗金鑒》，具有滋陰降火之功效,主治陰虛火旺、骨蒸潮熱證。它對慶大霉素致視網膜血管損傷的保護作用可能在14天之后，即病變的更晚期階段，才能表現出來，因為視網膜血管炎癥后期往往瘀熱傷陰，此時治宜滋陰涼血，佐以散瘀之品。

上述分析提示，在臨床上對于視網膜血管疾病的中醫藥治療，我們可以根據疾病的不同分期、不同分型，選擇使用相應的治則方藥，從而獲得良好的療效。早期熱毒壅盛，宜用黃連解毒湯以清熱解毒；中期血脈瘀阻，用桃紅四物湯以活血化瘀；晚期陰虛內熱，可以用知柏地黃湯以養陰清熱，同時結合患者病情，配合使用其它藥物治療。

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3 江 偉，王志強，李慶生，等.犀角地黃湯對慶大霉素致視網膜血管損傷的療效觀察[J].中國中醫眼科雜志，2008，18（5）:253-256.

4 江 偉，王志強，李慶生，等.慶大霉素玻璃體腔注射對兔視網膜血管的影響[J].國際眼科雜志，2006，6（3）:599-602.

5 張惠蓉，夏英杰，田 力.微機圖像定量分析視網膜靜脈阻塞的新生血管與無灌注區的關系 [J].中華眼科雜志，1992，28（6）:335-337.

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7 陳凌燕，陳 峰.桃紅四物湯在眼科臨床治驗[J].中國鄉村醫藥雜志，2003，10（2）:36-37.

8 曹于平，阜 聰，孫繼紅.黃連解毒湯提取物的藥理作用研究[J].中國藥科大學學報，1996，27（10）:605-608.

9 楊麗波，金 航.黃連解毒湯對血小板功能的影響[J].國外醫學·中醫中藥分冊，1994，16（1）:29-30.