高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中硝基呋喃代謝物的研究

張平安，張建威，喬明武，唐貴芳

(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮 (AOZ)、呋喃它酮 (AMOZ)、呋喃西林 (AHD)和呋喃妥因，是合成廣譜抗生素，發現于1944年，曾作為治療藥物和飼料添加劑，用于治療和預防埃希氏菌和沙門氏菌引起的哺乳動物消化道疾病。由于硝基呋喃類藥物對人類健康具有潛在危害，歐盟將其列為A類禁用藥物，并于1995年禁止在食用動物中使用。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令［1-2］。目前，硝基呋喃類藥物是國際動物源性食品貿易的必檢項目，成為發達國家限制第三國出口的貿易壁壘［3］。

硝基呋喃代謝產物可在酸性條件下水解，同時可用鄰硝基苯甲醛 (2-NBA)衍生化，經提取和凈化后，用液相色譜 (HPLC-UV)［3］、液相色譜質譜法［4］、液相色譜串聯質譜法測定［4］。通常 LC-UV法只能檢測AOZ和AMOZ，且檢出限達不到歐盟規定的要求。而對于HPLC-MS歐盟認為只能用于硝基呋喃代謝產物的篩選實驗，對檢出的陽性結果必須再用HPLC-MS-MS進行驗證。

我們采用代謝物水解與衍生化同步進行，液液萃取凈化，液相色譜串聯質譜檢測，電噴霧電離正離子 (ESI+)，多反應監測 (RMR)模式檢測，外標法定量，檢驗其在蜂蜜中硝基呋喃類藥物及其代謝物測定上的適用性。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

乙腈 (色譜純);甲醇 (色譜純);甲酸 (色譜純);乙酸乙酯 (色譜純);二甲亞砜;衍生劑(鄰硝基苯甲醛2-NBA);氫氧化鈉 (優級純);鹽酸 (優級純)硝基呋喃代謝物標準品:AOZ、SEM·HC1、AMOZ、AHD·HC1(Sigma公司，純度＞99.99%)。

1.2 儀器設備

API 4000液相色譜質譜聯用儀:安捷倫1100液相色譜系統，三重四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源;渦旋混合器;電子天平;恒溫箱;pH計;離心機;旋轉蒸發儀;氮氣吹干儀;5 mL移液槍;5 mL注射器;0.45 μm慮膜。

1.3 樣品處理

1.3.1 水解及衍生

稱取1.00 g蜂蜜樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，振蕩15 min。4 000 r·min-1離心3 min，棄去上清液，加30 mL濃度為0.125 mol·L-1鹽酸溶液，振蕩5 min，加1.0 mL衍生劑快速混合振蕩5 min后，置于37℃恒溫箱反應16 h(過夜)。

1.3.2 凈化

向水解溶液中加入1.5 mL濃度為2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調節溶液pH值到7.0。4 000 r·min-1下離心5 min，將上清液傾入250 mL分液漏斗中，殘渣用5 mL水洗滌振蕩2 min，4 000 r·min-1下離心2 min，上清液并入分液漏斗中。向分液漏斗中加入40 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，靜置3 min。分層后將下層水相轉移至另一分液漏斗中，用40 mL乙酸乙酯再提取1次，棄去水相。用10 mL水依次洗滌2個分液漏斗，棄去水相。

將乙酸乙酯層通過裝有2 g無水硫酸鈉的漏斗過濾至平底燒瓶中。50℃下旋轉蒸發至3 mL左右，移至8 mL玻璃試管中，用5 mL乙酸乙酯分3次洗滌合并洗滌液于試管中，50℃氮氣流下吹干。用定容液定容至1.0 mL，通過0.45 μm濾膜過濾至進樣瓶中，進樣LC-MS-MS分析。

1.3.3 液相和質譜系統條件

色譜柱。inertsil:ODS-3(2.1×150 mm，5 μm)。流動相組成為:(A)0.1% 甲酸溶液，(B)乙腈，梯度洗脫程序詳見表 1。流速:0.3 mL·min-1。色譜柱溫度:5℃。進樣量:10 μL。

質譜系統條件。離子源:Turbo Ion Spray電噴霧。離子化方式:電噴霧正離子 (ESI+)電噴霧電壓。5 500 V。離子源溫度:450℃。氣簾氣壓力:20 kPa。掃描方式:多重反應監測 (MRM)，其參數見表2。

表1 流動相組成和梯度洗脫程序

表2 多重反應監測的參數

1.3.4 標準曲線

取4種衍生過的代謝物混標 (各含100 ng·mL-1)5.0 mL用甲醇稀釋至50.0 mL容量瓶中，濃度為10 ng·mL-1。分別取 10 ng·mL-1的上述混標100.0，200.0，500.0 μL和 1.0 mL，用定容液分別定容至1.0 mL，通過0.45 μm濾膜過濾至進樣瓶中。則標準系列的濃度分別為1.0，2.0，5.0 和 10.0 ng·mL-1。

2 結果與分析

2.1 被測物的提取和衍生

鑒于硝基呋喃類抗生素代謝物以蛋白結合物形態存在于機體組織中，在適當酸性條件下，才能釋放出來，對蜂蜜樣品先用甲醇/水 (1+1)處理，可以去除大量的雜質，減少分析干擾。然后選擇0.125 mol·L-1的鹽酸溶液作為水解溶液。

硝基呋喃代謝物的分子量較小 (75～201)，在該范圍內MS背景影響大，檢測靈敏度低，故需衍生化后才能測定。采用鄰硝基苯甲醛 (2-NBA)對代謝物的自由氨基團衍生化，形成具有較好質譜特性的化合物。水解與衍生化同時進行，而蜂蜜樣品的基體主要是糖類，且為液體，因此所需時間較短，此處蜂蜜樣品的質譜信號達到最大值的衍生反應時間為12 h。

2.2 凈化條件的選擇

雖然LC-MS-MS具有良好的選擇性，但為使離子化過程穩定重現，樣品凈化的好壞直接影響到結果的重現性。本研究中，在萃取之前將水解衍生后的樣液過濾后再萃取，其回收率很低。試驗中曾將調好pH值的試劑添加溶液直接過 Oasis HLB，分別用氨水、甲醇、乙酸乙酯等洗脫發現其回收率偏低 (表 3)。

由表3可知，采用固相萃取尚未找到合適的條件，有待于進一步研究。因此，以乙酸乙酯為提取劑，采用液-液萃取模式，是非常有效的，同時還可以提高濃縮倍數，降低最小檢測限 (LOD)。

2.3 LC-MS-MS條件的優化

HPLC條件的優化。使用inertsil:ODS-3色譜柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相，做梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1，對目標化合物可獲得很好的分離。硝基呋喃代謝物的保留時間見表4。硝基呋喃衍生物標準品的提取離子流詳見圖1。

質譜條件的優化。由于硝基呋喃類抗生素代謝物為強極性物質，含有電負性強的原子，因此用TurboIonSpray?離子源，正離子方式，先用Q1全掃描，找出準確的M+1峰，然后分別以此為母離子，通過改變碰撞電壓進行轟擊，找出2～3個信號較強的碎片離子，以母離子與子離子組成監測離子對，以多反應檢測 (multiple reaction monitor，MRM)對待測物進行定性和定量分析，同時優化質譜條件。觀測了不同質譜參數 (噴霧電壓、碰撞電壓等)對測定結果的影響，結果表明，隨著噴霧電壓的增大，硝基呋喃類代謝物的衍生物的信號響應值逐漸增大，當噴霧電壓為5.5 k V時達到最大值，隨后趨于平緩。通過對每種硝基呋喃代謝物衍生物的碰撞能量優化，碰撞電壓在15～32 V范圍內，分子離子峰 ［M+1］斷裂產生特征性碎片離子。

表3 試劑添加過HLB固相萃取小柱的情況

表4 硝基呋喃代謝物的保留時間

圖1 硝基呋喃衍生物標準品的提取離子流

2.4 線性方程和檢測限

由實驗可知，硝基呋喃4種代謝物在1～10 μg·kg-1內線性良好，相關系數均大于0.998 2，符合儀器分析方法的要求 (表5)。

2.5 回收率和精密度

方法的檢出限理論上為被測物質豐度較弱子離子的信號/噪聲比 (S/N)≥3，在此前提下通過向陰性樣品中添加標準物質，外標法計算，稱樣量和進樣量來驗證方法的回收率。4種代謝物回收率在83.5% ～95.7%(表6)，相對標準偏差小于7.3%(表7)。呋喃唑酮，呋喃它酮，呋喃西林，呋喃妥因的檢出限定為 0.5 μg·kg-1。

表5 硝基呋喃4種代謝物的回歸方程和相關系數

表6 蜂蜜中添加4種代謝物的回收率

表7 測定結果的精密度

3 小結

本研究采用代謝物水解與衍生化同步進行，液液萃取凈化，液相色譜串聯質譜檢測，多重反應監測，外標法定量，成功地測定了出口蜂蜜中硝基呋喃類抗生素代謝物。標準曲線線性良好，定量限、檢測限均達到比較滿意的結果，可以滿足目前對進出口蜂蜜的檢測要求。

［1］ 彭濤，邱月明，李淑娟，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定動物肌肉中硝基呋喃類抗生素代謝物 ［J］.檢驗檢疫科學，2003，13(6):23-25，28.

［2］ 彭濤，儲曉剛，楊強，等.高效液相色譜/串聯質譜法測定奶粉中的硝基呋喃代謝物 ［J］.分析化學研究報告，2005，33(8):1073-1076.

［3］ 郭德華，汪國權，王東輝，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘留量 ［J］.分析測試學報，2005，14(4):167-18.

［4］ Bernhard W，Christian S，Hans(J)A R.安捷倫液相/離子阱 (XCT)質譜檢測蝦仁及家禽中的硝基呋喃代謝物 ［J］.環境化學，2004，23(6):717-721.